谷红注射液对新生大鼠脑缺氧缺血损伤的保护作用研究*

袁 丹 常能彬 梁玉兰 李 茂

（1.四川省泸州市人民医院，四川 泸州 646000；2.西南医科大学，四川 泸州 646000）

新生儿缺氧缺血性脑病是威胁新生儿生命健康的主要疾病之一，可造成新生儿永久性神经功能障碍，目前临床以对症支持治疗为主，尚无特效疗法。谷红注射液是一种复方制剂，由乙酰谷酰胺和红花提取液制成，具有抗氧自由基、活血化瘀、改善微循环等多种功效［1］。氧化应激产生大量自由基和脂质过氧化产物损伤脑细胞，在脑损伤的作用机制中发挥重要作用［2］。细胞外调节蛋白激酶（ERK）/核因子E2相关因子2（nuclear Nrf2）/血红素加氧酶1（HO-1）通路是抗氧化防御系统中的重要信号通路，可通过清除自由基等降低氧化应激反应［3］。本研究观察谷红注射液对缺氧缺血新生大鼠脑损伤的保护作用并探讨其分子机制，为缺血性脑疾病的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 126只健康7 d龄SD新生大鼠，体质量8～15 g，购自西南医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（川）2017-0003。在光照和黑暗环境交替、相同温度和湿度条件下，由母鼠自由喂养。

1.2 试药与仪器 谷红注射液，通化谷红制药有限公司，国药准字H22026637，批号20150925；ERK抑制剂SCH772984，纯度98.06%，MCE中国；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSPPx）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ERK和p-EERK抗体，美国Santa Cruz公司；Nrf2和HO-1抗体，英国Abcam公司，货号ab128075；β-actin和FITC标记山羊抗兔IgG，北京中杉金桥科技有限公司；ELx800-MV型酶联免疫检测仪，美国Bio-Tek公司；XS205型电子天平，瑞士梅特勒-托利多科学仪器；Chemi Doc TM XRS+型凝胶成像仪及电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 造模与分组 从126只新生大鼠中随机选取18只作为假手术组，其余新生大鼠参照文献方法建立缺氧缺血模型［4］。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉后仰卧位固定于手术板上，75%酒精消毒，颈部正中切口，结扎鼠左侧颈总动脉，缝合切口。术后恢复2 h，将新生大鼠置于缺氧箱中，通入8%O2和92%N2的混合气体，气流量2.0 L/min，缺氧2 h。假手术组大鼠除不结扎左侧颈总动脉之外，其他处理相同。缺氧缺血新生大鼠随机分为模型组，谷红低、中、高剂量组，ERK抑制剂LY3214996组（ERK组）和ERK+谷红组。

1.4 给药方法 造模结束4 h后给药。谷红低、中、高剂量组分别按剂量2.5、5、10 mL/kg腹腔注射谷红注射液［5］；ERK 组按剂量 10 μL/kg腹腔注射 LY3214996（5 nmol/L）［6］；ERK+谷红组同时腹腔注射LY3214996和10 mL/kg谷红注射液；假手术组和模型组腹腔注射等量（10 mL/kg）生理盐水。每12小时给药1次，共给药5次。

1.5 大鼠神经功能缺陷评分 给药结束后，从每组中随机选取6只，参照文献方法对各组大鼠神经功能缺陷进行评分［7］。神经功能无缺陷记为0分；左侧前肢伸展不完全，为轻度神经功能缺损，记为1分；新生大鼠在行走过程中转圈，为中度神经功能缺损，记为2分；新生大鼠在行走过程中倾倒，为重度神经功能缺损，记为3分；新生大鼠意识不清，不能自发行走，记为4分。神经功能缺损评分越高，说明新生大鼠损伤越严重。

1.6 标本采集与检测 1）大鼠脑组织HE染色：各组大鼠神经功能缺陷评分后，腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉后打开胸腔，生理盐水灌注心脏，去除血液，后改用4%多聚甲醛灌注，大鼠全身僵硬后，立即取出脑组织，采用4%多聚甲醛固定，经脱水、石蜡包埋、切片后HE染色，置于光学显微镜下观察各组新生大鼠脑组织病理变化。2）大鼠脑组织含水量检测［8］：随机取每组大鼠各6只，断头处死，快速取出脑，从矢状缝切开，称取新生大鼠右脑组织质量为湿质量。置于100℃烘箱中烘24 h，称量记为干质量。脑组织含水量（%）=（脑组织湿质量-脑组织干质量）/脑组织湿质量×100%。3）大鼠脑组织MDA、SOD和GSP-Px测定：取剩余新生大鼠缺血侧脑组织，冲洗除去残血，用滤纸吸干后立即精确称质量，加入4℃预冷的生理盐水制成10%组织匀浆，离心（4 000 r/min，10 min）后取上清液，-20℃保存备用。严格按照MDA、SOD和GSP-Px试剂盒操作说明检测各指标。4）Western blotting法检测大鼠脑组织p-ERK、Nrf2和HO-1蛋白表达：取适量各组新生大鼠脑组织，加入预冷的蛋白裂解液于冰上裂解30 min，离心（4℃，12 000 r/min，10 min），取上清液-80℃保存备用。BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后半干法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入一抗，4℃孵育过夜。冲洗后加入二抗，室温孵育2 h。冲洗后ECL显色，以β-actin为内参，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（）表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料用n表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量比较 见表1。假手术组新生大鼠无神经功能缺损症状，模型组新生大鼠在行走时出现转圈、意识不清、无法正常行走等现象。与假手术组比较，模型组新生大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，谷红中剂量组、谷红高剂量组和ERK+谷红组新生大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量均显著降低（P＜0.05）。与ERK组比较，ERK+谷红组新生大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量均显著降低（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠脑组织病理变化比较 见图1。假手术组新生大鼠脑组织结构清晰，细胞排列规则，细胞轮廓正常，中央有细胞核，核仁明显。模型组神经细胞排列紊乱，极性不清，细胞萎缩、核固缩，神经细胞退化、坏死和凋亡，一些细胞表现出核凝结和间质水肿，空泡变性和核结构不清楚。谷红高剂量组脑组织细胞明显改善，形态接近假手术组，凋亡和坏死细胞较模型组显著减少。ERK组脑组织细胞与模型组变化相似，细胞出现核萎缩等现象，ERK+谷红组细胞形态较ERK组也显著改善，坏死细胞减少。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量比较（±s）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分及脑组织含水量比较（±s）

与假手术组比较，◇P＜0.05；与模型组比较，◆P＜0.05；与谷红高剂量组比较，△P＜0.05；与ERK组比较，▲P＜0.05。下同

组别假手术组模型组谷红低剂量组谷红中剂量组谷红高剂量组ERK组ERK+谷红组n 6 6 6 6 6 6 6神经功能缺损评分（分）0 3.74±0.27◇3.61±0.24 2.63±0.19◆1.02±0.08◆3.82±0.36 2.51±0.18◆△▲脑组织含水量（%）80.07±5.97 96.98±6.43◇90.04±6.59 88.31±6.51◆81.75±6.05◆98.43±7.26 88.97±5.02◆△▲

图1 各组大鼠脑组织病理观察（HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠脑组织MDA、SOD和GSP-Px表达比较 见表2。与假手术组比，模型组新生大鼠脑组织MDA显著升高（P＜0.05），SOD和GSP-Px活力显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，谷红中剂量组、谷红高剂量组和ERK+谷红组新生大鼠脑组织MDA显著降低，SOD和GSP-Px活力显著升高（P＜0.05）。与ERK组比，ERK+谷红组新生大鼠脑组织MDA显著降低，SOD和GSP-Px活力显著升高（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠脑组织ERK/Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达比较 见表3。与假手术组比较，模型组新生大鼠脑组织p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，谷红中剂量组、谷红高剂量组和ERK+谷红组新生大鼠脑组织p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达显著升高（P＜0.05）。与ERK组比较，ERK+谷红组新生大鼠脑组织p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达显著升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠脑组织MDA、SOD和GSP-Px表达比较（±s）

表2 各组大鼠脑组织MDA、SOD和GSP-Px表达比较（±s）

组别假手术组模型组谷红低剂量组谷红中剂量组谷红高剂量组ERK组ERK+谷红组n 6 6 6 6 6 6 6 MDA（nmol/mg）1.52±0.25 5.46±1.15◇5.09±1.08 3.61±0.67◆2.21±0.28◆5.61±1.19 3.94±0.72△▲SOD（U/mg）17.85±1.63 5.72±1.05◇6.43±1.26 10.15±1.38◆14.98±1.57◆5.16±0.98 11.85±1.43△▲GSP-Px（U/mg）54.28±5.62 15.43±2.51◇17.15±2.68 32.85±4.19◆50.51±5.04◆14.02±2.48 28.26±2.92△▲

表3 各组大鼠脑组织p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠脑组织p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达比较（±s）

组别假手术组模型组谷红低剂量组谷红中剂量组谷红高剂量组ERK组ERK+谷红组n 6 6 6 6 6 6 6 p-ERK 1.12±0.13 0.10±0.01◇0.12±0.02 0.36±0.02◆0.91±0.10◆0.09±0.01 0.63±0.08◆△▲Nrf2 1.02±0.09 0.12±0.01◇0.13±0.02 0.37±0.03◆0.82±0.08◆0.11±0.02 0.54±0.05◆△▲HO-1 1.13±0.14 0.32±0.02◇0.33±0.03 0.42±0.04◆0.78±0.09◆0.26±0.03 0.51±0.04◆△▲

图2 各组大鼠脑组织p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达

3讨论

氧化应激是脑损伤的主要机制之一。脑缺血缺氧可使抗氧化防御系统受损，氧自由基的产生和清除的动态平衡受到破坏，导致机体内活性氧（ROS）累积，引起氧化应激［9］。谷红注射液可增加脑缺血再灌注（I/R）大鼠脑组织GSH-Px活性，降低LDH含量，对I/R大鼠发挥脑保护作用［10］。谷红注射液可降低氧糖剥夺损伤大鼠脑微血管内皮细胞NO和MDA含量，高SOD和GSH-PX活性，改善细胞形态，减少缺氧诱导的凋亡细胞数量，其机制可能与增强细胞抗氧化能力和抑制细胞凋亡有关［11］。本研究结果显示，新生大鼠在缺血缺氧后，神经功能评分和脑组织含水量显著升高，脑组织MDA显著升高，SOD和GSP-Px活力显著下降。谷红注射液主要是由乙酰谷酰胺和红花提取物制成的灭菌水溶液，红花提取液中有效成分为红花苷类和红花黄色素，具有扩张血管的作用，增加脑组织抗缺血缺氧能力；乙酰谷酰胺可经血脑屏障维持神经应激能力，改善脑功能［12］。现代药理学研究发现，谷红注射液可降低胶质细胞和海马神经元Caspase-3酶活性，抑制红细胞聚集，从而降低全血黏度，还可提高纤维蛋白溶解酶活性，加快血栓溶解，增加脑血流量，改善脑循环［13］。本研究发现谷红注射液干预后，可降低缺氧缺血新生大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑组织MDA含量，提高SOD和GSP-Px活力，提示谷红注射液可通过提高抗氧化酶活性降低氧自由基对脑组织的损伤。

ERK/Nrf2/HO-1信号通路的激活可降低细胞或组织中的氧自由基，保护细胞或组织免受损伤。Nrf2作为亮氨酸拉链转录激活因子家族成员，机体受到氧化应激刺激时，Nrf-2与细胞骨架相关蛋白发生解离后进入细胞核，进而促进HO-1蛋白的表达，磷酸化的ERK可以促进Nrf2激活［14-15］。HO-1对细胞具有保护作用，可催化血红素产生胆绿素和铁等物质，胆绿素可形成胆红素，二者是体内强有力的自由基清除剂［16］。马慧萍等研究发现，急慢性脑缺血大鼠神经功能学评分、梗死体积显著增加，GSH-Px和SOD活力、Nrf2和HO-1蛋白表达降低，白杨素可激活Nrf2/HO-1通路，减轻急慢性脑缺血损伤，对海马神经损伤起保护作用［17］。本研究结果显示，缺氧缺血新生大鼠脑组织蛋白表达显著下调，谷红注射液干预后，p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达显著上调。且与ERK抑制剂组比较，ERK抑制剂和谷红注射液共同干预后，新生大鼠SOD和GSP-Px活力、p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达较均显著升高，神经功能缺损评分和脑组织含水量以及MDA含量均显著降低，提示谷红注射液可激活ERK/Nrf2/HO-1信号通路，促进p-ERK、Nrf2、HO-1蛋白表达降低了脑组织氧化应激，进而对缺氧缺血新生大鼠发挥脑保护作用。

综上所述，谷红注射液可降低缺氧缺血新生大鼠神经功能缺损评分，减轻脑水肿和病理学损伤，提高脑组织抗氧化酶活性，对缺氧缺血新生大鼠神发挥脑保护作用，其作用机制可能与激活ERK/Nrf2/HO-1信号通路相关。