基于气道炎症调控的全真一气汤干预肾气虚型哮喘大鼠的机制研究*

张 晶 陈志斌 王春娥 李大治

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003）

支气管哮喘（简称哮喘）是一种气道慢性炎症性疾患，常反复发作，迁延不愈，严重影响患者的身体健康。哮喘的这种慢性气道炎症性疾患会引起气道炎性细胞浸润、气道高反应性及气道黏液黏蛋白分泌的变化。近年来的多项研究均证实水通道蛋白5（AQP5）与气道炎性细胞浸润、气道高反应性及气道黏液黏蛋白分泌的变化有着密切的关系，影响到哮喘的发生［1-3］。前期临床研究发现，全真一气汤能改善肾气虚型哮喘患者临床症状，但机制尚不明确［4］。本实验通过观察全真一气汤对肾气虚型哮喘大鼠AQP5的影响，旨在探讨其对炎症的调节机制，为全真一气汤治疗肾气虚型哮喘的临床应用提供一定的理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠39只，体质量（200±20）g，浙江省实验动物中心提供。许可证编号：SCXK（浙）2014-0001。恒温，恒湿，自由饮水，普通饲料喂养。

1.2 药物与仪器 全真一气汤原方［熟地黄15 g，白术6 g，麦冬15 g，淡附子6 g，人参15 g（生晒参），牛膝15 g，五味子6 g］，于福建中医药大学附属第二人民医院中药房加工成生药含量0.2 g/mL的溶液。卵蛋白（货号GradeⅡ，A5253，美国Sigma公司），灭活百日咳杆菌疫苗（上海生物制品研究所有限责任公司，批号20011103，规格2mL/支），Rat IL-4 ELISA试剂盒（R&D Systems，R4000），Rat TNF-α ELISA试剂盒（R&D Systems，RTA00），Rat AQP5 ELISA试剂盒（cusabio，CSBE08258r），BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（碧云天），其分析级化学试剂购自南京化学试剂厂。

1.3 分组与造模 大鼠置于福建中医药大学屏山校区动物房清洁级设施内，标准颗粒饲料喂养，自动取食饮水，室温20℃，自然光照，预适应7 d。后采取随机数字表法随机分为5组，对照组7只，每日予以正常饲料和饮用水喂饲；模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，各8只，依以下方法造模：通过腹腔注射1 mg卵蛋白、10 mg氢氧化铝凝胶、5×108个灭活百日咳杆菌疫苗混合成的1 mL溶液，超声雾化吸入1%的卵清白蛋白30 min，激发哮喘，同时通过惊恐刺激及在水深50 cm、水温20℃的水槽中游泳，完成肾气虚型哮喘大鼠模型的制备［5-6］。大鼠食量减少，体质量增幅减轻，拱背蜷卧，皮毛蓬松无光泽，活动量减少，行动迟缓，悬尾抵抗力减弱，游泳时间缩短，哮喘激发后出现喘息、呼吸困难、咳嗽，四肢抓挠口鼻、躁动、口唇发绀，听诊双肺闻及哮鸣音可纳入研究范围。

1.4 干预方法 对照组、模型组大鼠依正常组动物饲养方法每日喂养，模型组并每日给予0.9%氯化钠注射液3 mL经口灌胃；各中药组除每日予以正常饲料和饮用水喂饲外，开始给予药物干预，给予全真一气汤［人参15 g（生晒参），麦冬15 g，熟地黄15 g，淡附子6 g，白术6 g，牛膝15 g，五味子6 g］原方汤剂生药量按体重换算为大鼠剂量。每日灌胃3 mL，并分为低剂量治疗组（8.33 g/kg）、中剂量治疗组（16.66 g/kg）和高剂量治疗组（33.32 g/kg），共30 d。

1.5 标本采集与检测 1）取材方法。至少2人同时处理1只大鼠，称重后腹腔注入20%乌拉坦（1 g/kg）麻醉，将大鼠仰卧位固定，沿正中线剪开皮肤和腹壁肌肉，剪断两侧肋骨和胸肌，暴露胸腔，后从喉头以上剪断气管，将胸腔脏器一并取出，摘除心脏，分离肺脏，与此同时另一助手立于尾端，剪开腹腔，于腹主动脉取血8～10 mL。于右主支气管处切取右肺30 mg肺组织。标本血液送福建中医药大学附属第二人民医院检验科检查。2）ELISA试剂盒测定血清IL-4、TNF-α、AQP5水平。根据试剂盒说明书，稀释标准品，制作标准曲线，将包被好的96孔板取出，加入标准品和样本，置于37℃培养箱中孵育。培养2 h后，去除溶液。每孔加入100 μL生物素标记的抗体，贴上封口膜。置于37℃培养箱中孵育。培养1 h后，加入200 μL清洗缓冲液洗5次，每孔加入100 μL HRP标记的抗生物素蛋白，置于37℃培养箱中孵育。培养1 h后，加入200 μL清洗缓冲液洗5次，每次2 min。每孔加入90 μL TMB反应底物，置于37℃培养箱中避光孵育。每孔加入90 μL终止缓冲液，轻轻混匀。在酶标仪上450 nm波长处，检测吸光度。3）蛋白的提取和BCA蛋白浓度测定。切取30 mg组织，加入500 μL RIPA裂解液（每1 000 μL RIPA中加入10 μL PMSF，临用时加入），冰上研磨至无明显沉淀，冰上裂解30 min。裂解完后，将裂解液移至预冷的1.5 mL离心管中（冰上操作）。4℃下12 000 r/min离心5 min。将离心后的上清转移到1.5 mL离心管中，放于-20℃保存。根据碧云天BCA测定试剂盒说明书操作进行蛋白的含量测定。4）SDS-PAGE电泳。测完蛋白含量后，计算含30 mg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5 mL离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×SDS，于沸水中煮5 min使蛋白变性。浓缩胶层所用电压60 V，30 min电泳，进行转膜。5%脱脂奶粉TBST溶液封闭，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。将一抗用含5%BSA的TBST溶液按照1∶1 000稀释于4℃孵育过夜。之后用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min。将二抗用TBST按照1∶5 000稀释，室温下孵育2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min；进行化学发光反应。采用Thermo ECL进行化学发光，按照试剂盒说明书操作。于Tanon凝胶成像仪下拍照，获取图片。

1.6 统计学处理 应用SPSS23.0统计软件。计量资料以（）表示，两组比较用t检验；多组比较用方差分析，偏态分布用非参数检验，指标之间用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结 果

2.1 各组大鼠血清IL-4、TNF-α、AQP5水平比较 见表1。肾气虚型哮喘大鼠血清IL-4、TNF-α的水平均较对照组明显升高（P＜0.01），给予药物作用后，血清TNF-α、IL-4水平下调，且随药物剂量增加下调明显（P＜0.01）；相对于对照组，肾气虚型哮喘大鼠血清AQP5水平明显降低，给予药物作用后，随药物剂量的增加，其水平增加明显（P＜0.01）。

表1 各组大鼠血清中IL-4、TNF-α、AQP5水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清中IL-4、TNF-α、AQP5水平比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与全真一气汤低剂量组比较，▲P＜0.01；与全真一气汤中剂量组比较，□□P＜0.01。下同

组别对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n 7 8 8 8 8 IL-4（ng/mL）3.316±0.102 8.686±0.909*6.893±0.205*△5.617±0.178*△▲4.581±0.306*△▲□TNF-α（pg/mL）3.560±0.193 8.530±0.837*6.546±0.313*△5.189±0.629*△▲4.369±0.446*△▲□AQP5（ng/mL）798.611±73.833 252.446±18.436*341.026±26.432*△394.450±75.908*△▲547.539±15.827*△▲□

2.2 各组大鼠肺组织AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表达水平比较 见表2，图1。肾气虚型哮喘大鼠肺组织MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA的表达水平均较对照组明显升高（P＜0.01），给予药物作用后，肺组织MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表达水平下调，且随药物剂量增加下调明显（P＜0.01）；相对于对照组，肾气虚型哮喘大鼠肺组织AQP5 mRNA表达水平明显降低，给予药物作用后，随药物剂量的增加，其表达水平增加明显（P＜0.01）。

表2 各组大鼠肺组织AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表达水平比较（±s）

组 别n AQP5（GAPDH）MUC5AC（GAPDH）OX-62（GAPDH）对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组7 8 8 8 8 1.023±0.154 0.520±0.070*0.690±0.780*△0.819±0.059*△▲0.992±0.095△▲□0.532±0.116 1.131±0.098*0.964±0.410*△0.805±0.495*△▲0.709±0.048*△▲□0.517±0.134 1.201±0.089*1.070±0.094*△0.892±0.113*△▲0.765±0.109*△▲□

图1 各组大鼠肺组织AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA、肺组织OX-62 mRNA表达电泳图

3讨论

支气管哮喘由多种细胞、细胞组分及介质参与，它们之间的相互作用导致气道的慢性炎症，进而出现气道高反应性，表现反复发作性的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状，一般于夜间和（或）清晨发作、加剧。AQP5分布于I型肺泡上皮细胞，其基因或蛋白的表达降低是I型肺泡上皮细胞损伤的特异性标志［7］。在气道高反应过程中，AQP5出现表达下调的结果［8］。AQP5表达的降低同时也会促进哮喘的发生［9］。本实验结果显示：肾气虚型哮喘大鼠血清AQP5及肺组织AQP5 mRNA表达降低，气道炎症指标血清IL-4、TNF-α水平及肺组织MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表达水平均升高，表明AQP5水平的降低与肾气虚型哮喘大鼠气道炎症之间存在密切的关系。应用了逐渐增加剂量的全真一气汤以后，出现了两方面的结果，一方面肾气虚型哮喘大鼠血清AQP5及肺组织AQP5 mRNA表达均升高，且与剂量呈正相关；而另一方面血清IL-4、TNF-α水平及肺组织MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表达水平均降低，且与剂量呈负相关，说明肾气虚严重程度与AQP5降低水平及哮喘气道炎症严重程度之间存在相关性，而应用全真一气汤则能提高AQP5水平，改善肾气虚型哮喘大鼠的气道炎症。

支气管哮喘亦即中医所指的哮病、哮喘。中医“哮喘”之名由元·朱丹溪首创，并阐明病机专主于痰。痰的产生与体内津液代谢失常有关，《医门法律》云“上气而作水鸡声，乃是痰碍其气”。哮病具有遗传性，幼儿哮病往往由于先天禀赋不足所致，有称“幼稚天哮”，肾为先天之本，《素问·逆调论》说“肾者水脏，主津液”。肾的生理功能之一便是主水液，肾中精气的气化功能对于体内津液的输布和排泄，维持体内津液代谢的平衡起着极为重要的调节作用，肾气由肾精所化，为脏腑之气中最重要者，肾气涵有阴阳两种成分，其中肾阳为一身阳气之本，“五脏之阳气，非此不能发”，若肾阳虚衰，温煦、推动功能减退，机体新陈代谢减缓，津液的化生和运行输布障碍，痰饮内生；肾阴为一身阴气之源，“五脏之阴气，非此不能滋”，若肾阴不足，凉润功能减退，机体新陈代谢相对加快，也可影响津液的正常化生和运行输布，从而水湿内生，久之便可形成哮病的“宿痰”内伏于肺，复加致病因素引动发而为病，周而复始，反复发作。因此，哮病“宿痰”的产生与肾气虚程度有密切的关系。AQP5作为单纯的水通道蛋白，其只介导水分子跨膜转运，结合实验结果，考虑“痰”的产生与AQP5的低表达之间存在密切的关系，同时也会加重肾气虚型哮喘大鼠的气道炎症。因此提出肾气虚型哮喘大鼠肾气不足时，AQP5表达降低，肺水的通道不畅，肺水淤积于肺，则“宿痰”产生，气道炎症加重，促使哮喘的发生、发展。肾气不足改善后，AQP5表达增加，肺水通道顺畅，水分子正常通过，伏痰减少，气道炎症减轻，则哮喘症状改善。因此“补肾虚”便在肾气虚型哮病大鼠的治疗中发挥着重要的作用。全真一气汤由熟地黄、白术、麦门冬、附子、人参、牛膝、五味子组成，为明清医学大家冯兆张《冯氏锦囊秘录》中的经典方剂［10］。方中熟地黄、白术皆性甘，偏温，分补肾与脾，用养阴生津的麦冬俾土生金，以滋脾肺；附子温肾助阳，人参大补气阴；牛膝兼具补肾下行之功，五味子敛肺补肾，两者同用，更得纳气藏源。现代药理学研究发现，全真一气汤所含附子等药皆可以治疗及改善支气管哮喘的症状［11-18］。

综上所述，肾气虚型哮喘大鼠的气道炎症与AQP5低表达之间存在密切关系，全真一气汤可以改善肾气虚型哮喘大鼠的气道炎症，其机制考虑与提高AQP5表达的水平有关。