健脾益肠散对LPS诱导树突状细胞成熟标志CD83表达的影响*

蔺晓源 古 娟 钟日君 张嘉伦 赵应松 王 敏 刘杰民

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中医学国内一流建设学科，湖南 长沙 410208；3.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；4.贵州省人民医院，贵州 贵阳550002）

溃疡性结肠炎（UC）是一种反复发作的以腹痛、腹泻和便血等症状和体征为主要临床表现的特发性炎症性肠病［1］。UC病因尚不清楚，研究认为其发病与遗传、环境、感染、微生物群失调和免疫应答等因素密切有关［2］。树突状细胞（DC）是功能最强大的抗原提呈细胞，也是激发机体免疫应答反应过程中的始动细胞［3］；激活的DC是导致UC发生发展的关键启动子［4］。目前UC的西医治疗多采用免疫抑制剂及微生态制剂等联合用药，虽有成效，但仍面临副作用大、易复发等诸多问题难以解决。健脾益肠散是基于UC“本虚标实”的中医病机组方的名老中医（董菲洛教授）经验方，临床治疗UC安全有效，并能明显改善患者机体的免疫功能［5］，且健脾益肠散治疗UC的相关基础和临床研究荣获2017年度贵州省科技进步二等奖。为了进一步明确健脾益肠散治疗UC的免疫耐受机制，本研究从体外细胞角度观察了健脾益肠散对DC细胞成熟标志CD83表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10只SPF级SD大鼠，雄性，体质量220～250 g，用于制备含药血清。C57BL/6 小鼠，6～8周，雄性，体质量18～25 g，用于分离DC细胞。动物均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）2014-002。

1.2 试药与仪器 健脾益肠散（黄芪15 g，太子参15 g，白术12 g，白豆蔻6 g，木香6 g，败酱草30 g，补骨脂20 g，芡实12 g，茯苓12 g，炙甘草6 g）中药饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房，经鉴定符合国家药典标准。中药汤液按传统方法煎煮2次，第1次用蒸馏水浸泡30 min后武火煎开，再用文火煎煮30 min，过滤留取药液；第2次煎煮待武火煮开后文火煎煮20 min，过滤留取药液，将2次煎液混合后水浴锅加热浓缩成生药含量为3 g/mL的药液冰箱冷藏备用。RPMI 1640（Hyclone公司，SH30809.01）、胎牛血清（Gibco公司，10270-106）、rmGM-CSF（eBioscience，85-BMS325）、rmIL-4（RD 公司、404-ML-010）、CD1a（eBioscience，MA5-12526）、Fluorescein（FITC）-conjugated Affinipure Donkey Anti-Mouse（bioswamp，PAB 160025）、流式专用 Buffer（bioswamp，PAB180076）、脂多糖（LPS）（Sigma，L2630）、IL-10（RD，417-ML-005）、CD83兔抗多克隆抗体（abcam，ab170855）、蛋白质Marker（Thermo，26634）、RIPA（强）组织细胞快速裂解液（bioswamp，PAB180006）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（bioswamp，PAB180007）、YBR Green PCR试剂盒（KAPABiosystems，KM4101）、逆转录试剂盒（TAKARA，639505）。SW-CJ-2D超净工作台（苏州金净净化设备公司）、311型CO2恒温培养箱（Thermo公司）、MLS-3781L-PC高压灭菌锅（日本Panasohic）、Allegra X-30多功能离心机（贝克曼库尔特）、DMIL LED倒置荧光显微镜（Leica公司）、Moflo XDP分选型流式细胞仪（Beckman公司）、CytoFLEX S流式细胞仪（Beckman公司）、HT7700透射电镜（日立）、mini protean 3 cell电泳仪（BIO-RAD）、MK3酶标仪（芬兰雷勃）、Tanon-5200全自动化学发光分析仪（上海天能）、T100-Thermal Cycler PCR仪（BIO-RAD）、Universal HoodⅡ凝胶成像系统（BIO-RAD）。

1.3 DC细胞培养与鉴定 将C57BL/6小鼠用拉颈法处死后依次浸入75%乙醇中消毒10 min，无菌条件下剥离出股骨和胫骨，剪断骨头两端，露出内腔。用1 mL注射器吸取1 mL RPMI 1640培养液，将骨髓冲入到干燥无菌培养皿中，每根长骨反复冲洗直至骨髓腔呈白色近透明。用吸管反复吹打冲洗下来的骨髓至完全分散，无菌200目滤网过滤。收集骨髓细胞悬液到离心管中，离心10 min后弃上清液。用2 mL红细胞裂解液，4℃裂解3～5 min，裂解至溶液透亮后加入2倍以上体积的PBS，终止裂解。然后离心，PBS洗涤2次。用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为2×108/L，接种于6孔培养板，每孔2 mL，加入添加20 μg/L的rmGM-CSF和10 μg/L的rmIL-4培养基，置于CO2培养箱中培养，48 h后全量换液，之后隔天半量换液。倒置荧光显微镜下观察细胞形态，培养7 d后收集细胞进行下一步实验。DC细胞的鉴定：在无菌环境下，取EP管，各加入300 μL的单细胞悬液，CD1a标记，每管加入6 μL抗体，并设空标管。4℃孵育45 min后，PBS洗3次，300 μL流式Buffer重悬细胞，每管再加入3 μL荧光二抗［Fluorescein（FITC）-conjugated Affinipure Donkey Anti-Mouse］，4℃避光孵育45 min，PBS洗3次。染色完成后PBS稀释样本，调整细胞密度为1×107/mL左右。上流式分选型细胞仪分选，收集分选细胞。细胞如前染色后，400 μL流式Buffer重悬细胞，4℃避光保存，流式细胞仪上机检测，使用CYEXPERT分析软件进行分析。

1.4 含药血清的制备 SD大鼠随机分为两组：中药含药血清组和空白血清组。中药含药血清组按临床等效剂量3倍的健脾益肠散（13.6 mL/kg）灌胃，空白血清组灌胃等体积量蒸馏水，每日2次，连续3 d；末次灌胃结束后禁食，1 h后麻醉从腹腔采集动脉血，静置3～4 h，3 000 r/min，4℃离心20 min，分离血清；置于56℃水浴中灭活30 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，-80℃冷藏备用。

1.5 分组及干预 取生长状态良好的细胞，胰酶消化后调节细胞浓度，接种于细胞培养板，分组后按以下方法进行干预。空白对照组（不加任何刺激物质）、模型组（加入LPS）、中药含药血清组（加入LPS和健脾益肠散含药血清）、空白血清组（加入LPS和不含药血清）、IL-10组（加入IL-10）。加入血清浓度为10%。24 h后分别收集细胞和上清，进行指标检测。

1.6 指标检测 Western blotting法检测各组DC细胞CD83的蛋白表达；RT-PCR法检测各组DC细胞CD83的基因表达，取对数生长的细胞接种于12孔板中，每孔加1 mL细胞悬液。根据RT-PCR的操作方法进行样本总RNA的提取、cDNA第一条链的合成（总RNA中DNA的消除；总RNA中DNase1的消除；反转录：42℃，60 min；70℃，15 min；16℃，维持）和PCR扩增。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列见表1。数据采用仪器自带软件分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间的比较满足正态性检验后，方差齐时采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用Tamhane′s T2法。不满足正态性分布的采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 PCR引物情况

2结果

2.1 DC细胞形态特点及CD1a阳性细胞鉴定 见图1～图2。倒置荧光显微镜下观察显示，第3日时，可见排列紧密，聚集成团，表面光滑呈圆形的细胞；第5日时，细胞散开，体积变大；第7日时，部分细胞悬浮，贴壁细胞形态不规则，可见树突状分化。分选后的CD 1a阳性细胞经流式细胞仪检测其占总细胞量的92.00%以上，达到实验要求。

图1 DC细胞形态学观察（200倍）

图2 CD1a阳性细胞的特征性表型

2.2 健脾益肠散对DC细胞CD83蛋白表达的影响见表2，图3。模型组DC细胞CD83蛋白表达较空白对照组显著增多（P＜0.01）；中药含药血清组DC细胞CD83蛋白表达减少，与模型组和空白血清组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；IL-10组DC细胞CD83蛋白表达虽较空白对照组有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 健脾益肠散对DC细胞CD83 mRNA表达的影响 见表2，图4。与空白对照组比较，模型组DC细胞CD83的mRNA表达明显增多（P＜0.05）；中药含药血清组DC细胞CD83的mRNA表达减少，与模型组和空白血清组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；IL-10组DC细胞CD83的mRNA表达较空白对照组降低（P＜0.05）。

表2 各组DC中CD83蛋白和mRNA表达比较（±s）

表2 各组DC中CD83蛋白和mRNA表达比较（±s）

与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与中药含药血清组比较，*P＜0.05。

组别空白对照组模型组中药含药血清组空白血清组IL-10组CD83 mRNA 1.18±0.12 1.36±0.15#1.22±0.13△1.40±0.12*1.07±0.10#CD83蛋白0.44±0.05 0.82±0.09##0.61±0.07△0.86±0.10*0.38±0.04

图3 各组DC细胞CD83蛋白免疫印迹电泳图

图4 各组DC细胞CD83 mRNA表达曲线图（RT-PCR）

3讨 论

DC细胞是目前所知道的功能最强且唯一能够激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞，而肠内DC细胞决定着免疫反应的性质和种类［6］。损伤肠黏膜屏障功能的因素均可导致UC的发生，结肠黏膜DC细胞浸润的频率与UC活动性炎症的严重性显著关联［7］。曾敬清等证实了炎症性肠病患儿肠黏膜组织中的DC表型分子DC-SIGN表达增强，由此介导DC细胞参与炎症性肠病的正负免疫调节［8］。目前DC细胞功能障碍促使UC发展的机制主要与在炎症性黏膜上维持T细胞反应性及作为效应细胞释放炎性因子有关。

DC细胞的主要标志为CDla，经体内外抗原活化后高表达CD83，而体内未经抗原活化的DC及体外新鲜分离的DC则低表达CD83，因而CD83被认为是DC细胞充分成熟的标志［9］。根据DC细胞发育分化的不同阶段，分为未成熟 DC（imDC）及成熟DC（mDC），不同成熟状态的DC具有能够正向或负向调节T细胞的免疫功能。imDC具有较强的抗原吞噬能力，以及很强的加工和处理抗原的能力，而提呈抗原并刺激初始T细胞活化的能力很弱，能够诱导机体的中枢性和外周性免疫耐受，故在诱导免疫耐受中发挥重要作用。mDC可有效激活Th细胞免疫应答，发挥细胞毒性T淋巴细胞效应，此过程将摄取的抗原进行处理，并以复合物的形式递呈到细胞表面，再通过DC表面的双信号分子把抗原递呈给初始T淋巴细胞，有效激活T细胞免疫应答，在诱导免疫应答中发挥重要作用。故在免疫耐受的过程中，DC细胞的一个重要机制可能是通过专职释放免疫抑制因子，导致免疫应答向免疫耐受方向发展［10］。

近年来研究发现，促进imDC向mDC转化的因子有LPS、淋巴细胞、中性粒细胞、免疫复合物等；抑制imDC向mDC转化的因子有抑炎因子（如IL-10）、糖皮质激素类、干细胞等［11］。有学者验证了LPS具有促进DC向成熟方向分化的作用；也有研究表明，DC在受LPS刺激成熟过程中，DC共刺激分子的表达与LPS存在一定的剂量关系，随着刺激浓度的增加表达量也随之增加［12］。IL-10具有拮抗LPS促成熟作用，能降低DC表面分子的表达，从而可以诱导耐受性DC的产生［13］。笔者前期的研究显示，健脾益肠散能促进UC模型大鼠血清IL-10含量升高［14］，推测其可通过拮抗LPS促DC成熟而达到UC免疫耐受的作用。

UC属中医学“泄泻”“肠癖”等范畴，其本在于脾气亏虚，其标在于气滞、湿热和血瘀［15］。王爱华教授也认为，UC的根本病机为本虚标实，脾虚失运为其本，湿热、热毒为其标，日久夹瘀，脾肾双亏［16］。因此，针对此本虚标实之证治宜扶正祛邪、标本兼治。健脾益肠散方中黄芪补气固表、敛疮生肌、固肠御邪为君；太子参益气健脾，白术健脾益气、燥湿利水，白豆蔻化湿行气，木香行气止痛、抗菌止泻，败酱草清热行瘀消痈，共为臣药；补骨脂补肾止泻，芡实益肾补脾止泻，茯苓健脾渗湿，共为佐药；甘草补脾益气，缓急止痛，调和诸药为使。前期研究发现，健脾益肠散可通过促进热休克蛋白70的表达、降低CD40分子的表达而起到对UC大鼠结肠黏膜的免疫保护作用［17-18］。

本实验结果显示，LPS干预DC细胞后，其成熟标志CD83的蛋白和mRNA表达均较空白对照组增强，说明LPS诱导了DC细胞的成熟；IL-10干预DC细胞后，CD83的mRNA表达较空白对照组减弱，证实IL-10可抑制DC细胞向成熟状态转化。健脾益肠散含药血清干预LPS诱导的DC细胞后，CD83的蛋白和mRNA表达均较模型组降低，表明健脾益肠散含药血清可抑制DC细胞的成熟。以上结果表明健脾益肠散治疗UC的免疫耐受作用可能是通过抑制DC细胞的成熟状态来实现。此外，本实验的研究意义还在于体外成功分离出数量多、纯度高、活性好的DC细胞，并采用流式细胞术对其特异性标志物CD 1a细胞进行鉴定，为后续体外研究DC细胞免疫机制相关疾病的发病及中药干预奠定了良好的实验基础。