茶基质对气相色谱法定量分析有机磷农药的影响

张 艳,聂青玉,*,王圣开,付 勋

(1.重庆三峡职业学院,重庆 404155; 2.重庆市万州食品药品检验所,重庆 404155)

茶树一般生长于温暖湿润的气候环境,容易发生病虫害。目前,茶树虫害超过800种，已经发现的茶树病害超过130种[1]。茶树使用农药已经超过80种,常见农药为有机磷类、有机氯类农药[2]。随着病虫害耐药性增加,使用农药剂量、种类日益增多,茶叶中农药残留已经严重影响了茶产品的质量安全。目前,茶叶农药残留的分析方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法等[3-7]。由于茶叶中含有多种有机酸、咖啡碱、游离糖、儿茶素、色素、锌、硒、锰等微量物质[8],这些成分在农残测定中,常会产生基质效应,即对于相同浓度的农药,其在基质溶液中的色谱响应会比其在纯溶剂中的响应高,从而影响待测农药组分定量的准确性[9-10],因此研究茶基质对农残测定的影响很有必要。

近年来,有关茶叶农药残留的分析研究主要集中在检测色谱条件的优化、样品前处理、茶叶茶汤中农药残留的测定等方面[11-15],而茶基质对GC-NPD(气相色谱-氮磷检测器)法定量分析有机磷农药的影响报道较少。考虑到茶叶是冲泡后饮用茶汤,所以溶出到茶汤中的残留农药及其它有害物质也可能会影响人体健康。因此,本试验选取茶叶、茶汤为基质,气相色谱法分析两种基质对敌敌畏、毒死蜱、甲基对硫磷3种农药线性的影响;通过不同加标水平,比较添加基质标准曲线与纯溶剂标准曲线两种校正方法对测定结果准确度和精密度的影响,以期优化气相色谱定量分析有机磷农药残留的方法,提高检测结果准确度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

移都秀芽 重庆聚缘川秀茶叶有限公司;敌敌畏、毒死蜱、甲基对硫磷农药标准品(纯度99%) 中国标准物质中心;乙腈(色谱纯)、丙酮、无水硫酸镁、氯化钠 成都市科龙化工试剂厂;石墨化碳(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)(色谱纯) 博纳艾杰尔公司。

Agilent GC 7890A气相色谱仪(带氮磷检测器NPD) 安捷伦科技有限公司;NVL5100B天平 奥豪斯仪器有限公司;Mixplus漩涡振荡仪 合肥艾本森科学仪器有限公司;HR2084打浆机 珠海飞利浦家庭电器有限公司;MD-200氮吹仪 杭州佑宁仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 茶叶:新购茶叶经粉粹后,过20目筛制成粉状试样。茶汤:取茶样3 g置于茶杯中,按茶水比(质量体积比)1∶50注入沸水,加盖计时4 min,滤出茶汤[14]。

1.2.2 样品前处理 分别称取茶叶5 g、茶汤10 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中,用20 mL乙腈溶液提取,旋涡混匀2 min,超声提取10 min后过滤,滤液收集到装有2～3 g氯化钠的具塞量筒中,剧烈振荡后静置,使乙腈相和水相分层。吸取4.00 mL上清液于装有0.1 g PSA,0.1 g GCB和0.3 g无水硫酸镁的离心管中[15-16],涡旋2 min,于8000 r·min-1条件下离心 5 min。取 2.00 mL上清液于刻度试管中,40 ℃氮吹至近干,用丙酮定容至2.00 mL,过0.22 μm有机系滤膜上机[17]。

1.2.3 GC条件 色谱柱:19091J-413(30 m×320 μm×0.5 μm);载气为氮气;氮气流速为11 mL/min,氢气流速为3 mL/min,空气流速为60 mL/min;隔垫吹扫流量:5 mL/min,溶剂延迟3 min;进样口温度:250 ℃,NPD检测器温度340 ℃;升温程序:初温80 ℃,以20 ℃/min升温至120 ℃,保持2 min,以20 ℃/min升温至230 ℃,保持3 min,以10 ℃/min升温至250 ℃,保持3 min;进样方式:脉冲不分流进样,进样量为1.0 μL[18]。

1.2.4 标准曲线绘制 标准储备溶液的配制:将3种农药标准品(敌敌畏、毒死蜱、甲基对硫磷)用丙酮稀释定容配制成3种农药浓度均为10 μg/mL的混标储备溶液。吸取10 μg/mL的3种农药标准储备溶液,丙酮稀释成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的标准溶液,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制纯溶剂标准曲线。称取按上述样品前处理和检测条件下检测确定不含上述3种农药的茶叶5 g、茶汤10 g,按1.2.2样品前处理方法提取、净化、浓缩近干后,分别加入0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的3种农药混合标准溶液2.00 mL,上机检测,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制基质标准曲线。

1.2.5 准确度和精密度实验 选取茶叶5 g、茶汤10 g,加入一定量10 μg/mL混合标准溶液储备液,茶叶基质3种农药理论加标量为0.4、0.8、2.0 mg/kg、茶汤基质3种农药理论加标量为0.1、0.2、0.4 mg/kg,按1.2.2提取、净化、浓缩后加入2 mL丙酮定容,上机检测。每个加标水平做3个平行试验,计算加标回收率及相对标准偏差。

1.3 数据处理

本文所用数据均采用Excel软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 有机磷农药混标色谱图

NPD检测器BLOS铷珠经过72 h老化后,输出电压0.68 V时,输出值大于20,趋于稳定。考虑到有机磷类农药吸附问题,换用带玻璃毛超高惰性衬管5190-2293。3种农药的混合标准溶液连续进样6次。经反复试验,按1.2.3色谱条件进样分析,3种农药混标色谱图见图1。图1显示,敌敌畏、甲基对硫磷和毒死蜱分别在6.517、11.321、12.114 min出峰,3种农药具有较好的分离效果。 6次重复进样3种农药峰面积RSD为1.35%～2.58%,重现性好。

图1 敌敌畏、甲基对硫磷和毒死蜱混标色谱图Fig.1 The mixed-label chromatogram of dichlorvos,methyl parathion and chlorpyrifos注:1:敌敌畏;2:甲基对硫磷;3:毒死蜱。

2.2 基质对标准曲线线性的影响

分别用丙酮及茶叶、茶汤基质按1.2.4方法配制纯溶剂标准溶液及基质标准溶液进行测定。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,结果见图2～图4。如图2～图4所示,茶叶茶汤配制的标准曲线与纯溶剂标准曲线相比,用基质配制标准溶液的响应值明显高于同浓度的纯溶剂标准溶液响应值,说明基质增强效应明显。这是因为茶叶中含有色素、有机酸、矿物质等基质成分,基质成分对待测组分提取、净化除杂环节造成干扰,同时在色谱分离时,基质成分与待测组分共洗脱,从而影响待测成分的检测。采用同一种农药基质标准曲线斜率与纯溶剂标准曲线斜率之比判断同一基质对不同农药的基质效应影响。以茶叶为基质配制敌敌畏、甲基对硫磷和毒死蜱得到的标准曲线斜率与不添加基质标准曲线斜率之比分别为1.25、1.18和1.06;以茶汤为基质配制敌敌畏、甲基对硫磷和毒死蜱得到的标准曲线与不添加基质标准曲线斜率之比分别为1.11、1.08和1.03,由此得出,茶叶茶汤对3种农药的基质效应为敌敌畏>甲基对硫磷>毒死蜱。

图3 甲基对硫磷标准曲线Fig.3 Standard curve of parathion methyl

图4 毒死蜱标准曲线Fig.4 Standard curve of chlorpyrifos

3种有机磷农药在0.05～1.00 μg/mL的浓度范围内,线性方程、决定系数、检出限(LOD)、定量限(LOQ)结果见表1(LOD、LOQ分别以最低添加水平色谱图中3倍、10倍噪声表示)。通过对2种基质与纯溶剂标准溶液进行线性比较分析可知:3种农药线性方程的决定系数R2均大于0.99,无明显差异,LOD均低于0.02 mg/kg,LOQ低于0.04 mg/kg,有较高灵敏度,能够满足定量分析要求[20]。

表1 3种有机磷农药在溶剂、基质中的线性方程、R2、检出限和定量限Table 1 Linear equations,R2,LOD and LOQ of three organophosphorus pesticides in solvent and matrices

2.3 基质对回收率及精密度的影响

以茶叶、茶汤为样品的加标回收试验,分别按表1的基质与纯溶剂标准曲线进行校正,计算加标回收率及相对标准偏差,结果见表2和表3。

表2 3种有机磷农药基质标准曲线计算准确度和精密度结果(n=3)Table 2 Accuracy and precision calculated by matrix standard curve of three organophosphorus pesticides(n=3)

表3 3种有机磷农药溶剂标准曲线计算准确度和精密度结果(n=3)Table 3 Accuracy and precision calculated by solvent standard curve of three organophosphorus pesticides(n=3)

由表2、表3可知,以添加基质标准曲线定量,3种农药回收率范围74.75%～113.20%;而以纯溶剂标准曲线定量,回收率范围为80.40%～133.80%,其中茶叶加标回收实验中,敌敌畏、毒死蜱和甲基对硫磷理论加标量为0.4 mg/kg时,回收率分别为133.80%、123.60%、129.80%,理论加标量为0.8、2.0 mg/kg时,回收率均小于120%,由此得出,基质对低浓度农药影响大于对高浓度农药的影响。通过纯溶剂标准曲线与添加基质标准曲线两种定量方法比较,发现低浓度加标水平实验中,基质标准曲线定量的回收率更接近100%,高浓度加标水平实验中,纯溶剂标准曲线定量得到的回收率更接近100%。这是因为基质效应的大小与分析物浓度大小有关。当农药浓度低,由于茶叶基质成分的存在,减少色谱系统活性点与待测成分作用机会,使检测信号增强。随着待测农药浓度增大,基质效应减小,基质增强效应反而能够弥补气相色谱检测方法过程中提取不彻底、净化、浓缩损失、膜吸附等原因造成的回收率偏低的情况。同一种农药在同一加标水平采用纯溶剂标准曲线定量的回收率均高于基质标准曲线定量的回收率,具有明显的基质增强效应。3种农药在茶叶、茶汤中加标,两种定量方式得到的相对标准偏差在0.79%～6.57%之间。同一农药在同一空白样品同一加标水平中,两种校正方法得出RSD略有差异,但无明显变化规律。

3 结论

GC-NPD分析方法测定有机磷农药,农药分离效果较好,3种有机磷农药6次连续进样的峰面积RSD值1.35%～2.58%,重现性好。考查茶叶、茶汤基质对敌敌畏、甲基对硫磷和毒死蜱的线性、准确度和精密度的影响,结果表明:3种农药在0.05～1.00 μg/mL的浓度范围内,决定系数无明显差异,R2均大于0.99,具较高的灵敏度;同种农药基质配制标准溶液响应值明显高于同浓度纯溶剂标准溶液,说明基质增强效应明显。通过纯溶剂标准曲线与添加基质标准曲线两种定量方法比较,相对标准偏差在0.79%～6.57%之间,无明显差异;基质对低浓度加标水平实验回收率影响较大,而高浓度加标水平实验中,溶剂标准曲线定量得到的回收率更接近100%,准确度更高。本实验只以移都秀芽为研究对象,对其他品种茶叶对有机磷定量分析的影响有待进一步研究。