幽门螺杆菌感染对功能性消化不良病儿发病的影响

姚珊珊 杨林 田字彬 张翠萍 杨鑫 韩磊

[摘要]目的探讨幽门螺杆菌（HP）感染对功能性消化不良（FD）病儿发病机制的影响。方法收集诊断为FD的病儿100例，确定其消化不良症状的严重程度并进行评分，行13C尿素呼气试验明确HP感染情况。根据HP检测结果将病儿分为HP阳性组与HP阴性组，对HP阳性组病儿检测其毒力因子细胞毒素相关蛋白A（CagA）抗体，根据其结果进一步分为CagA阳性组与CagA阴性组。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测各组病儿血清中相关胃肠激素的表达水平;行胃镜检查时取胃黏膜组织进行苏木精-伊红（HE）染色，对胃黏膜炎症程度进行评分并观察炎性细胞浸润情况;行实时荧光定量PCR检测胃黏膜中相关炎症因子与趋化因子mRNA的表达水平。以健康查体儿童100例作健康对照。结果FD病儿HP感染率（60%）显著高于健康对照儿童（15%），差异有显著性（χ2=43.2，P<0.01）。HP阳性组CagA阳性者占80%，与CagA阴性组、HP阴性组相比，CagA阳性组病儿的消化不良症状积分明显增高（F=91.26，q=6.73、19.08，P<0.01），胃黏膜炎症程度与炎性细胞浸润亦明显增加;血清5-羟色胺与瘦素水平明显降低，促胃液素与胃促生长素水平明显增高，差异均有显著意义（F=622.35～3 724.33，q=5.29～122.04，P<0.01）;胃组织中炎症因子IL-17、INF-γ与趋化因子CXCL13、CCL2的mRNA表达水平均显著增高，差异有统计学意义（F=413.72～842.75，q=16.11～57.98，P<0.01）。结论HP感染可能是儿童FD的重要致病因素之一;HP感染可能通过CagA的作用影响胃肠激素的分泌与局部黏膜免疫反應而参与FD的发病。

[关键词]消化不良;幽门螺杆菌;胃肠激素;趋化因子类

[中图分类号]R725.7[文献标志码]A[文章编号]2096-5532（2019）03-0257-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of Helicobacter pylori （HP） infection on the pathogenesis of functional dyspepsia （FD） in children. MethodsA total of 100 children diagnosed with FD were enrolled. The severity of dyspepsia was determined and scored， and the 13C-urea breath test was performed to identify HP infection. According to the results of HP detection， the children with FD were divided into HP-positive group and HP-negative group. Based on the results of cytotoxin-associated protein A （CagA） antibody detection， the children in the HP-positive group were further divided into CagA-positive group and CagA-negative group. ELISA was used to measure the expression of related gastrointestinal hormones in serum. Gastroscopy was performed to collect gastric mucosa for HE staining， the degree of gastric mucosal inflammation was determined， and the infiltration of inflammatory cells was observed. Quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of associated inflammatory cytokines and chemokines in gastric mucosa. A total of 100 healthy children who underwent physical examination were enrolled as healthy control group. ResultsThe children with FD had a significantly higher HP infection rate than the healthy children （60% vs 15%， χ2=43.2，P<0.01）. In the HP-positive group， the children with positive CagA accounted for 80%. Compared with the CagA-negative group and the HP-negative group， the CagA-positive group had a significantly higher symptom score of dyspepsia （F=91.26，q=6.73 and 19.08，P<0.01）， significant increases in the degree of gastric mucosal inflammation and the infiltration of inflammatory cells， significant reductions in the serum levels of 5-hydroxytryptamine  and leptin， and significant increases in the levels of gastrin and ghrelin （F=622.35-3 724.33，q=5.29-122.04，P<0.01）. Compared with the CagA-negative group and the HP-negative group， the CagA-positive group had significant increases in the mRNA expression of the inflammatory cytokines interleukin-17 and interferon-γ and the chemokines CXCL13 and CCL2 in gastric tissue （F=413.72-842.75，q=16.11-57.98，P<0.01）. ConclusionHP infection may be one of the important pathogenic factors for FD in children. HP infection may participate in the pathogenesis of FD by affecting the secretion of gastrointestinal hormones and local mucosal immune response via CagA.

[KEY WORDS]dyspepsia; Helicobacter pylori; gastrointestinal hormones; chemotactic factors

功能性消化不良（FD）是以反复发作的餐后饱胀、早饱、厌食、嗳气、恶心、呕吐、上腹痛、上腹烧灼感或泛酸为主要表现，而经各项检查排除器質性、系统性或代谢性疾病的一组临床常见症候群。FD病程有慢性、迁延性特点，难以自行缓解，严重影响了病人的生活质量[1-3]。在我国，成年人FD发病率为10%～30%，占消化科门诊病人的40%左右[4]。虽然儿科病人中FD的发病率尚无规范统计，但FD也已成为儿科消化门诊常见的就诊原因[5]。FD的发病机制尚不清楚，目前认为是多因素综合作用的结果，如胃肠运动功能障碍、内脏高敏感性、胃酸分泌异常、幽门螺杆菌（HP）感染以及精神心理因素等[6-8]。其中HP与FD关系密切，表现为FD病人HP感染率较高[9]，根除HP治疗可改善部分FD病人的消化不良症状[10-11]。HP可能通过影响胃部炎症反应、胃酸分泌以及胃肠激素等途径引起FD症状[12-13]，但同时也有部分临床研究的结果并不支持HP感染是FD的致病因素这一结论。HP的临床分离株基因差异性较大，表现为明显的基因多样性，其中细胞毒素相关蛋白A（CagA）是HP最重要的毒力因子[14]。根据是否存在CagA，可以将HP菌株分为Ⅰ型菌株（CagA阳性）和Ⅱ型菌株（CagA阴性），Ⅰ型菌株较Ⅱ型菌株能引起更严重的胃黏膜损伤与炎症，以及更高的患胃癌的概率[15]。CagA在FD发病机制中的作用需进一步研究。本研究通过分析HP感染及其抗体分型对FD病儿症状、血清胃肠激素、胃黏膜炎症程度及相关炎症因子与趋化因子表达等影响，探讨HP感染在FD发病机制中的作用，以期为FD病儿临床诊治提供依据。

1对象与方法

1.1病例收集

收集2017年1—12月我院儿科门诊诊治的FD病儿100例，其中男38例，女62例;年龄4～14岁，平均（8.7±5.5）岁。以反复发作的餐后饱胀、早饱、厌食、恶心、呕吐、上腹痛、上腹烧灼感或泛酸为主要表现，经各项检查排除器质性、系统性或代谢性疾病，符合功能性胃肠病罗马Ⅳ诊断标准[16-17]。同时选取来我院行13C尿素呼气试验的健康查体儿童100例作为对照。两组儿童性别、年龄、体质量指数（BMI）差异均无统计学意义。本研究经我院伦理委员会批准，所有受试者和（或）其监护人均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2检测指标及方法

1.2.1症状积分评估通过对病儿及其家属仔细询问，确定病儿上腹不适症状的严重程度并进行评分。评分标准：轻度（1分），不适症状间断出现，不影响学习或生活;中度（2分），不适症状频繁出现，一定程度上影响学习或生活;重度（3分），不适症状持续出现，严重影响了学习或生活。

1.2.2HP感染检测采用13C尿素呼气试验方法。检测前1个月停止服用质子泵抑制剂、铋剂及抗生素等，检测前空腹4 h以上。首先采集病儿基线呼气标本，随后再服用13C标记尿素，30 min后收集病儿呼气作为测定标本。采用德国Wagner公司生产的红外线能谱仪检测服用尿素前后的呼气标本，当测定标本原子丰度值大于基线呼气标本5个百分点时，判断为HP感染阳性。

1.2.3血清学检查收集FD病儿空腹血4 mL，离心后获得血清。根据13C尿素呼气试验结果将100例病儿分为HP阳性组和HP阴性组。取HP阳性组病儿血清，采用免疫印迹法检测CagA抗体（试剂盒购自深圳市伯劳特生物制品有限公司，操作按试剂盒说明进行），根据CagA抗体检测结果进一步将HP阳性组病儿分为CagA阳性组与CagA阴性组。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测FD病儿血清中5-羟色胺、促胃液素、瘦素、胃促生长素等胃肠激素水平（试剂盒购自上海晶莹生物技术公司，操作按试剂盒说明进行）。

1.2.4胃镜组织学检查100例FD病儿中42例在麻醉下行胃镜检查，由有资质的儿科内镜医师进行操作。检查时，于距幽门2～3 cm的胃窦大弯侧、距贲门8 cm的胃体大弯侧各取2块组织，其中1块用于苏木素-伊红（HE）染色，观察有无HP感染并请两位病理学专家观察其病理组织学变化及中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞的浸润情况，依据修订的胃炎分类与分级的悉尼系统对胃黏膜炎症进行评分，轻、中、重度分别为1、2、3分[18]。

1.2.5胃黏膜炎症因子检测取胃镜检查获取的胃窦与胃体组织，提取RNA，测定RNA的纯度和浓度后，取1 μg的RNA进行逆转录反应以得到cDNA，用SYBR Green试剂盒（TaKaRa）进行实时荧光定量PCR，利用△△Ct法确定胃黏膜中炎症因子白细胞介素17（IL-17）、干扰素（IFN）-γ、趋化因子CXCL13、CC趋化因子配体（CCL）2的mRNA相对表达水平。实验所用引物序列见表1。

1.3统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料结果以±s表示，两组比较采用t检验;多组间比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用SNK检验;计数资料比较采用χ2检验或Kruskal-Wallis秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1FD病儿与健康儿童HP感染率的比较

FD病儿13C尿素呼气试验测得HP感染率为60%，显著高于健康儿童（15%），差异有统计学意义（χ2=43.2，P<0.01）。HP阳性组血清CagA抗体阳性48例（80%），CagA抗体阴性12例（20%）。对各组病儿消化不良症状积分情况进行比较，CagA阳性组病儿消化不良症状最明显，其积分明显高于CagA阴性组与HP阴性组（F=91.26，q=6.73、19.08，χ2=7.87，P<0.01）;HP阴性组病儿消化不良症状最轻，积分低于CagA阳性组，差异有显著性（q=5.81，P<0.01）。见表2。

2.2FD病儿胃镜下表现与胃黏膜组织学变化

HE染色检测到HP阳性FD病儿58例，其阳性率（58%）与13C尿素呼气试验测得的HP感染率（60%）比较，差异无显著性（χ2=0.08，P>0.05）。胃镜下观察显示，HP阴性组病儿黏膜大致正常，炎性细胞浸润较少，炎症积分最低（F=192.33，q=27.42、13.64，χ2=14.62，P<0.01）;而CagA陽性组病儿可见黏膜轻度充血，散在片状红斑，胃黏膜炎性细胞浸润较多，炎症积分最高（q=4.28，P<0.01）。见表3。

2.3各组FD病儿血清胃肠激素水平比较

与HP阴性组相比较，CagA阴性组病儿血清中的5-羟色胺明显增高（F=622.35，q=34.38，P<0.01），瘦素和胃促生长素明显降低（F=3 724.33、688.72，q=45.23、36.54，P<0.01），促胃液素水平差异无统计学意义（P>0.05）。CagA阳性组病儿血清中的促胃液素和胃促生长素水平均明显高于CagA阴性组（q=52.63、5.29，P<0.01），5-羟色胺、瘦素水平明显低于CagA阴性组，差异有统计学意义（q=49.39、34.83，P<0.01）。见表4。

2.4各组FD病儿胃黏膜炎症因子与趋化因子mRNA表达比较

与HP阴性组比较，CagA阳性组病儿胃组织中IL-17、INF-γ、CXCL13与CCL2的mRNA表达水平明显增高，差异有统计学意义（F=413.72～842.75，q=40.41～57.98，P<0.01）;CagA阳性组病儿胃组织中IL-17、INF-γ、CXCL13与CCL2的mRNA表达水平明显高于CagA阴性组，差异亦有统计学意义（q=14.85～20.28，P<0.01）。见表4。

3讨论

FD是一种无器质性病变发现、非溃疡性胃肠功能性疾病，在消化不良中约占50%以上，根据不同病理生理学基础和病人的主要症状，可分为餐后不适综合征（PDS）和上腹痛综合征（EPS）两种亚型[4，16]。迄今为止，有关FD的病因与发病机制尚未完全明确，目前认为胃动力异常和内脏高敏感性是FD症状表现的重要病理生理学机制[1-2，4]。

HP感染是慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等上消化道疾病的重要致病因素，也与FD的发生密切相关[4，10-13，19-20]。我国FD病人中，HP阳性者占比可达39%～87%，对此类病人进行根除HP治疗有助于FD症状的改善。同时，国内外共识意见也明确推荐对HP阳性的FD病人进行HP根除治疗[4，20]。HP长期定植于胃黏膜，可导致炎症反应和免疫激活，使巨噬细胞、肥大细胞等在胃黏膜局部聚集，释放炎性细胞因子作用于胃肠道平滑肌、胃肠神经系统，影响胃肠道动力和内脏感觉功能[21-22]。CagA是HP主要的致病因子，可通过机体免疫应答作用激活炎症与肿瘤相关信号通路，最终导致胃黏膜炎症、溃疡或恶变。CagA的分布有地区差异性，在东亚的中国、日本和韩国，绝大部分都是CagA阳性菌株[23]。本研究结果显示，与健康儿童相比，FD病儿的HP感染率大大增加，且CagA阳性组病儿的消化不良症状与胃黏膜炎症程度均较CagA阴性组与HP阴性组严重，提示CagA阳性菌株定植于胃黏膜后可引起更明显的消化不良症状，说明HP感染及其毒力因子的炎性致病机制可能是FD病儿产生临床症状的重要原因，这也与我国HP感染率及CagA阳性率较高的现状相符合。

相关研究表明，FD病人存在胃肠动力的异常，包括胃排空延迟、胃十二指肠运动协调失常、胃平滑肌收缩节律紊乱等，这些异常与某些胃肠激素的分泌异常有着密切关系[1，21]。5-羟色胺是一种具有多重生物学效应的脑肠肽，具有促进胃肠道运动、调节十二指肠胃反射、调控胃蛋白酶和胃酸的分泌等作用，并参与调节情感、认知、情绪、睡眠等生理活动。促胃液素可收缩胃窦和幽门括约肌，延缓胃排空，并增生修复胃肠道黏膜及增加血流量，促进胃酸、胃蛋白酶、胰液的分泌及胰岛素、降钙素的释放。瘦素具有调节胃肠激素、延迟胃排空、保护胃肠黏膜、平衡能量代谢、抑制摄食等作用;胃促生长素则发挥增进摄食、促进胃酸分泌、促进胃肠道运动、保护胃黏膜、抑制炎症反应等多种胃肠道生理调节作用。以上各种激素在不同分组FD病儿血清表达水平差异存在显著性，表明HP感染及其毒力因子CagA可能通过影响胃肠激素的分泌释放来调节胃肠运动与免疫反应，参与FD的发病与消化不良症状的产生。

另一方面，既往研究也证实FD病人不仅胃黏膜存在着明显的炎性反应，其血清中炎性细胞因子水平也显著升高，推测慢性炎症在FD的发生、发展过程中扮演重要角色[24-25]。而HP感染导致FD的发生可能主要也是通过胃黏膜局部炎症反应来实现的[26]。CagA可激活核因子κB（NF-κB）信号通路并诱导IL-8、TNF-α等炎症因子表达的上调，参与黏膜炎症反应[15]。本文研究检测了HP阴性组、CagA阳性组、CagA阴性组FD病儿胃黏膜炎症因子IL-17、INF-γ和趋化因子CXCL13、CCL2的mRNA表达水平，结果显示HP感染及其毒力因子CagA可能通过上调胃黏膜相关炎症因子与趋化因子的表达参与FD的发病过程。IL-17与INF-γ是主要由活化的T细胞产生的致炎细胞因子，可介导中性粒细胞与巨噬细胞等效应细胞的活化[27];而CXCL13、CCL2分别介导了淋巴细胞与单核细胞向炎症部位的趋化迁移[28]，这些炎症因子与趋化因子在黏膜表达的增加可诱导更多的炎症细胞在HP感染的局部聚集并激活，介导黏膜炎症与免疫反应，参与FD的发生。

综上所述，FD病儿HP感染率较健康儿童明显增加，其消化不良症状与胃黏膜炎症反应程度、血清胃肠激素与胃黏膜炎症因子、趋化因子的表达水平、HP感染及其毒力因子CagA密切相关，说明HP感染可能是导致儿童FD的重要致病因素之一，HP可能通过CagA的作用影响胃肠激素的分泌与局部黏膜免疫反应进而参与FD的发病，根除HP可作为治疗儿童FD的有效手段之一。同时本研究也存在某些局限性，如病儿的个体差异、环境、心理因素与FD发病的关系尚不明确，今后对其进行进一步研究将有助于更好地揭示小儿FD的发病机制。

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（本文编辑 黄建乡）