金属蛋白酶组织抑制因子在稽留流产患者绒毛组织中的表达及其意义

王开秀 程大梅 黄晓梅 邵帅 丁涛

摘要：目的：研究基质金属蛋白酶（MMP）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）在稽留流产患者绒毛组织的表达，探讨孕期高凝状态在稽留流产中的作用。方法：以2018年3月～2019年10月在荆门市第二人民医院诊断为稽留流产的45名患者为实验组，以同期45例正常妊娠要求行人工流终止妊娠的早孕健康妇女作为对照组，检测两者外周血纤维蛋白原降解产物（FDP）、D二聚体含量，绒毛组织中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）、VEGF蛋白表達水平。结果：实验组FDP及D二聚体均较对照组显著升高（P < 0.001）。实验组绒毛组织MMP-9蛋白表达量高于对照组，TIMP-1、VEGF蛋白表达量低于对照组（P < 0.05）。结论：稽留流产患者处于高凝状态，可导致胚胎停育，其机制与患者绒毛膜组织MMP-9升高，TIMP-1下降，VEGF下降有关。

关键词：稽留流产;绒毛组织;基质金属蛋白酶;血管内皮细胞生长因子

中图分类号：R714.21 文献标志码：A 文章编号：1008-4657（2019）05-0070-04

0 引言

稽留流产（Missed Abortion，MA）是指胚胎死亡或胎儿死亡而仍稽留于宫腔而未排出者，发生率约1%～5%，严重危害妇女生育健康，可导远期的不孕症、宫腔粘连等，最严重可导致永久性无法生育等，给患者身体和精神带来极大的痛苦[1-2]，对于社会稳定也是不利的。早期妊娠流产涉及的原因多，但主要与染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌失调、感染性疾病、免疫等因素有关[3]。通过临床病例分析，目前认为高凝状态可导致子宫-胎盘循环的局部异常，其最终可引起胚胎流产或胚胎发育不良，但其具体的机制不明[3-4]。因此，本研究通过临床病例标本研究，观察孕期高凝状态下早期妊娠稽留流产患者绒毛组织中MMP-9、TIMP-1、VEGF蛋白表达情况，探讨其在稽留流产中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年3月～2019年10月在荆门市第二人民医院就诊并确诊的稽留流产患者45例作为实验组，同期45例正常妊娠要求行人工流产终止妊娠的早孕健康妇女作为对照组。实验组患者经阴道彩超动态监测确诊为稽留流产，所有纳入对象均满足入选标准：（1）无高血压病史或家族史，无恶性肿瘤病史及家族史，无免疫性疾病史;（2）已排除急性炎症期，如急性阴道炎、急性盆腔炎。实验组与对照组患者的一般情况，经差异比较，无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 绒毛组织的获取

常规行流产手术时获取患者绒毛组织，利用医用生理盐水洗掉粘液及血液，剔除蜕膜组织，医用滤纸吸去水份，- 80℃冰箱保存绒毛组织。

1.2.2 凝血功能检测

两组妇女均于手术当天，空腹抽取外周静脉血5 ml，送至荆门市第二人民医院医学检验科常规检测FDP以及D二聚体含量。

1.2.3 绒毛组织MMP-9、TIMP-1、VEGF蛋白表达检测

提取组织蛋白并测其浓度。经Bradford法测总蛋白浓度。取提取的组织蛋白50 μg进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加入对应一抗，4 ℃孵育过夜。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育一个半小时，充分洗涤后，加入ECL超敏发光显色液显色。反应约3～5 min后，在暗室内用X光片曝光。将最后通过显液与定液出来的X光片利用凝胶成像系统软件分析条带积分光密度值（OD）及面积（Area）。计算相对光密度比值：相对光密度比值 =（目的蛋白光密度×面积）/（β-actin的光密度×面积）。

1.3 统计学分析

数据以均数 ± 标准差（ ± s）的形式进行描述，采用SPSS16.0分析。数据采用t检验或Mann-Whitney U。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本资料比较

实验组与对照组患者的一般资料比较如表1所示。

由表1可知，稽留流产患者年龄（27.13 ± 4.33）岁，孕龄（56.51 ± 8.08）天，正常早孕年龄（27.00 ± 4.32）岁，孕龄（53.64 ± 8.86）天，实验组和对照组之间在怀孕年龄以及停经天数上比较，两组数据无显著统计学差异（P > 0.05）。

2.2 外周血FDP及D二聚体含量比较

实验组与对照组患者外周血FDP及D二聚体含量如表2所示。

由表2可知，实验组FDP及D二聚体含量较对照组高，差异均具有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 MMP-9、TIMP-1及VEGF蛋白表达水平比较

Western Blot检测MMP-9、TIMP-1及VEGF蛋白表达量，结果如表3所示。

由表3可知，与对照组相比，稽留流产患者的绒毛组织中的MMP-9、VEGF蛋白表达量升高，TIMP-1蛋白表达量下降，差异均具有统计学意义（P < 0.05）。

3 结论

稽留流产患者外周血FDP（4.96 ± 0.77l）μg/ml、D二聚体（0.72 ± 0.24）μg/ml分别较对照FDP（3.40 ± 1.07）μg/ml、D二聚体（0.37 ± 0.12）μg/ml含量高，说明稽留流产患者血液相对于正常妊娠，血液是呈高凝状态。

稽留流产患者绒毛组织MMP-9蛋白表达量（0.55 ± 0.12）高于对照组（0.38 ± 0.11）高;TIMP-1蛋白表达量（0.24 ± 0.12）、VEGF蛋白表达量（0.30 ± 0.08）分别较对照组TIMP-1蛋白表达量（0.30 ± 0.10）、VEGF蛋白表达量（0.43 ± 0.15）低，表明稽留流产患者与正常妊娠患者相比，其绒毛组织血管形成能力较低。

4 讨论

妊娠期体内雌孕激素水平升高，对肝脏的代谢、合成、分泌功能均造成影响，使孕妇机体纤溶活性逐渐减低呈高凝状态，其本身有一定的积极作用，但严重的高凝状态，易导致流产。相对于自然流产而言，稽留流产患者机体凝血和纤维蛋白溶解系统呈失衡状态，患者更加具有血栓形成倾向。本研究的结果表明，稽留流产患者FDP及D二聚体水平较对照组升高，患者处于明显高凝状态，不仅影响胚胎着床和发育，同时患者凝血功能障碍，可影响胚胎与子宫壁间的组织机化，使妊娠组织与子宫壁间的粘连更加紧密，這样将加大流产手术的难度，严重的可导致子宫穿孔、大出血等严重并发症。

基质金属蛋白酶（MMP）是重要水解蛋白酶，参与细胞外基质（ECM）的代谢[5-6]，在血管形成起着重要的作用，在人类胎盘形成过程发挥重要作用。滋养层入侵需要精确调节分泌特定的蛋白水解酶，其能降低子宫内膜基底膜和细胞外基质。胚胎侵入子宫能力和子宫内膜蜕膜化能力是胚胎着床的关键，而这一过程伴随着多种细胞外基质降解和重构。胚胎植入母体子宫的过程中，MMP能够参与血管生成，其为着床后的胚胎提供必需的营养物质。MMP通过对蜕膜ECM的降解，从而防止胚胎与蜕膜间的分离而导致流产[5-7]。

金属蛋白酶类抑制剂（TIMP）是主要的内源性MMP抑制因子，在绒毛外滋养细胞入侵内膜基质中起关键作用。MMP和TIMP两者互相呈动态平衡状态，在胚胎与胎盘间有至关重要，尤其是MMP-9和TIMP-1[8]。滋养细胞过度侵袭，过度的蜕膜ECM降解，可导致胚胎植入的失败，进一步导致胎盘形成或发育不良，最终可以导致早期妊娠流产的发生[9]。

检测数据表明，实验组和对照组的流产绒毛组织中均有MMP-9和TIMP-1表达，且实验组绒毛组织中MMP-9蛋白表达水平高于对照组，而对照组绒毛组织中TIMP-1蛋白表达量明显高于实验组。因此，间接提示稽留流产的发生可能与绒毛组织MMP-9及TIMP-1蛋白异常有关。

VEGF在血管生成方面具有强大的功能，不仅可以调节血管通透性，促进新生血管的形成，为新生微血管网的生长提供必要的基质[10-11]，还可作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞及滋养细胞的分裂和迁移，刺激微血管的生成，引起细胞外基质改变。VEGF在胚胎的着床、植入、内膜发育过程中起着关键性的作用。VEGF表达下降使得血管内皮细胞的增殖、迁移的调控及促进血管形成功能异常，导致胚胎的供血出现异常，从而影响胚胎的正常发育;而且入侵能力的下降，导致滋养细胞的浸润减少，胚胎着床不稳定，导致流产的发生[12-13]。本研究实验组VEGF蛋白表达水平低于对照组。表明高凝状态下VEGF表达，其可能是流产的机制之一。

通过临床标本的研究，妊娠早期处于高凝状态的患者，绒毛膜组织中MMP-9蛋白高表达，以及TIMP-1蛋白和VEGF蛋白低表达，可能会导致胚胎与母体间的血管网形成不良、滋养细胞分化及浸润异常，最终导致发生流产和胚胎停止发育，其具体机制目前不明确，需进一步研究。

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[责任编辑：许立群]