反式脂肪酸对肥胖大鼠氧化还原态的影响

余辉艳 范荣 化轶男 佟超 钱晓蒙 肖荣 麻微微

摘 要：目的：利用高脂饲料建立大鼠肥胖模型，通过对添加不同剂量反式脂肪酸（TFAs）喂养的大鼠脑及血液氧化损伤相关指标比较，探讨TFAs对肥胖大鼠脑和血液抗氧化系统的影响机制。方法：健康雄性SD大鼠40只，随机分为4组：对照组（CON组）、喂饲基础饲料、饮食诱导的肥胖组（DIO组），喂饲高脂饲料，1%及8%反式脂肪酸组（1% TFAs、8% TFAs组）喂饲添加1% TFAs及8% TFAs的高脂饲料。8周后，心脏取血后，处死动物，留取脑组织及血液以检测相关指标。结果：不同饲料喂养8周后，8% TFAs组大鼠脑丙二醛（MDA）含量明显高于CON组、 DIO组与1% TFAs 组（P<0.01）;CON组、DIO组、1% TFAs及8% TFAs组大鼠脑还原型谷胱甘肽（GSH）含量依次显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）;1% TFAs组大鼠血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力低于DIO组、CON组（P<0.05）;与CON组相比，8% TFAs组大鼠脑核因子E2相关因子2（Nrf2）mRNA表达水平显著上调（P < 0.01）;8% TFAs组血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白表达水平显著高于CON组（P<0.05）、DIO组（P<0.05）及1% TFAs组（P<0.01）。结论：高含量TFAs摄入可引起肥胖大鼠血液和脑发生氧化损伤，上调氧化损伤相关基因和蛋白表达。

关键词：反式脂肪酸;氧化损伤;肥胖

大量研究表明，过多的摄入反式脂肪酸（TFAs）与心血管疾病[1-2]、2型糖尿病[3]、癌症[4-6]及婴儿发育不良[7]等慢性疾病的发生有一定关系。研究表明，TFAs能引起神经细胞氧化损伤，导致大脑认知功能衰退[8]。大量研究表明，中年超重或肥胖与老年痴呆、阿尔茨海默病及血管性痴呆风险增加独立相关[9]。而肥胖人群TFAs的摄入显著高于正常者，有研究显示，单饱和脂肪和多不饱和脂肪的摄入增加与体重增加无关，但动物脂肪、饱和脂肪和TFAs的增加与体重的变化有显著正相关[10-11]。TFAs的摄入增加，可能会加重肥胖人群机体氧化损伤，但具体机制还需要进一步探讨。因此，本实验通过建立肥胖大鼠模型，观察不同含量的TFAs的高脂肪饲料对大鼠脑和血液氧化损伤相关指标和核转录因子2（Nrf2）及血红素氧化酶（HO-1）信号通路分子的影响，探讨TFAs摄入对肥胖大鼠脑氧化损伤的影响机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

丙二醛、谷胱甘肽過氧化氢酶、谷胱甘肽、BCA（Bicinchoninic acid）蛋白检测试剂盒，南京建成生物工程研究所;HO-1单克隆抗体，美国Abcam公司;二抗（Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody），美国CST公司;Nrf2单克隆抗体，美国CST公司;二抗（Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody），美国CST公司;逆转录试剂盒，德国Thermo公司;通用型SYBR快速定量PCR试剂盒，美国KAPA公司;基因合成引物，由上海生工生物工程有限公司进行合成。

1.2 实验动物

1.2.1 动物及饲养 健康雄性SD大鼠40只，体重140～160g，SPF级别;动物饲养条件：动物饲养于SPF级实验动物中心，温度20～23℃，湿度50%～55%，自然采光。自由饮水及摄食，动物由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，并通过首都医科大学伦理委员会审查。动物合格证编号：SCXK-（京）2016-0011，伦理审查编号：AEEI-2017-002 首都医科大学伦理委员会。SPF级别基础饲料和高脂肪饲料，北京科澳协力饲料有限公司，分别为：基础饲料，高脂饲料（脂肪供能比45%）;1% TFAs，添加1% TFAs的高脂饲料;8% TFAs，添加8% TFAs的高脂饲料。

1.2.2 动物分组与处理 动物随机分为4组，对照组（CON，基础饲料）、肥胖组（DIO，高脂饲料）、1%反式脂肪酸组（1% TFAs，添加1%TFAs的高脂饲料）、8%反式脂肪酸组（8% TFAs，添加8%TFAs的高脂饲料）。动物喂养8周后，采用1%水合氯醛麻醉动物后，心脏取血，3 500r/min离心15min，留取血清。动物处死后，留取脑组织迅速转移至-80℃冰箱冻存，以检测相关指标。

1.3 方法

1.3.1 脑和血液氧化损伤指标的检测 将大鼠脑组织匀浆，用BCA检测试剂盒测定总蛋白含量。依照各个试剂盒说明书的步骤加样反应，使用多功能酶标仪（Infinite M200 PRO，奥地利Tecan公司）测定吸光度，根据标准曲线计算大鼠脑组织和血浆中还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力及GSH与GSSG比值。

1.3.2 脑组织氧化损伤相关基因水平的检测 Real-time PCR法检测肺组织HO-1、Nrf2 mRNA的表达。提取和纯化大鼠脑组织中的总RNA，按逆转录试剂盒说明书对RNA进行逆转录，使用美国Bio-Rad公司PCR仪进行扩增，所用引物序列见表1。结果采用Bio-Rad分析软件进行半定量分析，以GAPDH作为内参基因，目标基因相对表达量=2^（Ct目标- Ct内参）。

1.3.3 脑组织蛋白氧化损伤相关蛋白水平的检测Western blot法检测大鼠脑组织中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平。提取大鼠脑组织的总蛋白，将等量的蛋白（40 μg）在12% 的SDS-PAGE 中电泳，切取目的条带。300 mA 低温条件下转膜。在5%脱脂奶粉封闭液中常温封闭1 h。分别用大鼠HO-1、Nrf2、β-actin抗体4℃孵育过夜。将膜在TBST 中充分洗涤后，分别加入HRP 标记的二抗（Nrf2为抗兔抗体、HO-1为抗鼠抗体），常温孵育1 h。将膜取出，在TBST 中洗涤后，使用ECL 发光法进行显色反应，化学发光成像系统（Fusion SL6，法国vilber公司产品）进行显影扫描。

1.4 统计学方法

实验结果以±s表示。采用SPSS 22.0统计软件包进行数据正态和单因素方差分析，组间比较采用LSD法或用Dunnett-T3法检验，P <0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 TFAs对肥胖大鼠一般生长发育的影响

CON组、DIO组、1% TFAs和8% TFAs组大鼠一般状况良好。第8周大鼠体重各组间差异显著（P < 0.01）;与CON组比较，DIO组、1% TFAs组、8% TFAs组大鼠体重均显著升高（P<0.05）（表2）。

2.2 TFAs对肥胖大鼠抗氧化系统相关因子的影响

2.2.1 TFAs对肥胖大鼠脑GSH、MDA含量及 GSH-PX活力的影响 4组大鼠脑组织GSH水平呈下降趋势，差异具有统计学意义（P=0.002），其中CON组与1% TFAs组（P =0.016）、CON组与8% TFAs组（P< 0.001）、DIO组与8% TFAs组（P =0.004）之间有统计学差异;GSSG 4组间差异具有统计学意义（P=0.001），其中CON组与1%TFAs组（P=0.003）、CON

2.2.2 TFAs对肥胖大鼠血清GSH、MDA含量及GSH-PX活力的影响 表4显示，CON组、DIO组、1%TFAs组及8%TFAs各组大鼠血清GSH及MDA水平无明显差异;GSSG 4组间有统计学差异（P=0.045）;GSH/GSSG比值4组间无明显差异;GSH-PX活力4组间有统计学差异（P=0.028），其中与CON组与1%TFAs组（P=0.034）、DIO组与1%TFAs组（P=0.004）之间有统计学差异，1%TFAs组GSH-PX活力低于CON组和DIO组。

2.3.1 TFAs对肥胖大鼠脑组织Nrf2及 HO-1 mRNA表达情况的影响 PCR实验结果显示，与CON组比较，DIO组、1% TFAs组、8% TFAs组大鼠脑组织均上调Nrf2及HO-1RNA表达水平，其中8% TFAs组显著上调Nrf2 mRNA表达水平（P = 0.022），其余各组间增量不具有统计学意义（P>0.05）（图1）。

2.3.2 TFAs对肥胖大鼠脑组织Nrf2及 HO-1蛋白表达情况的影响 Western blot实验结果显示，与CON组比较，DIO、1% TFAs、8% TFAs组大鼠脑组织中Nrf2、HO-1蛋白表达水平均上调，其中8% TFAs组HO-1 蛋白表达水平显著高于CON组（P=0.002），8%TFAs组HO-1蛋白表达水平显著高于DIO组及1%TFAs组（P=0.021;P=0.024），其余各组间差异均不具有统计学意义（P>0.05）（图2）。

3 讨论

本实验以高脂肪饲料建立肥胖动物模型，结果显示，经过8周的饲料喂养，CON组及DIO组、1% TFAs、8% TFAs组大鼠一般生长发育状况良好，DIO组大鼠体重显著高于CON组，说明高脂肪饲料喂养建立的肥胖大鼠模型成功。

研究显示，MDA能间接反映氧自由基含量和氧化损伤的程度。GSH-PX是体内广泛存在的催化过氧化氢分解的酶，是内源性清除系统的抗氧化剂，是氧化损伤敏感的指标之一[12]。GSH作为GSH-PX的作用底物，可清除生物体内有害自由基或脂质过氧化物，使其轉换成脂肪酸和水，并转化成氧化型谷胱甘肽GSSG。GSH/GSSG 浓度比值受外界因素干扰少，能更准确地反映GSH/GSSG氧化还原对的还原能力[13]。

本研究表明，8周的不同饲料喂养条件下，CON组、 DIO组与1% TFAs 组在大鼠脑组织中的MDA含量无明显差异，8% TFAs组含量明显高于前3组，说明高含量TFAs（8% TFAs）摄入已导致健康及肥胖大鼠产生明显的氧化应激和脂质过氧化。CON组、DIO组、1% TFAs及8% TFAs组大鼠脑组织GSH含量依次显著下降，说明健康及肥胖大鼠脑组织中氧化损伤加重，而清除氧自由基的能力逐渐减弱。血清中1% TFAs 组GSH-PX活力低于DIO组、CON组，表示TFAs的摄入引起的氧化应激反应已在血液系统中有所体现。

Nrf2信号通路在调节细胞抗氧化应激反应中起着重要作用。HO-1是Nrf2调节的下游抗氧化酶基因的表达蛋白，近年来研究表明，HO-1 通过抗氧化损伤作用而发挥其神经保护作用[14-15]。本研究显示，在mRNA水平，与CON组比较，8% TFAs组显著上调Nrf2 mRNA表达水平。在蛋白水平，8% TFAs组HO-1 蛋白表达水平显著高于CON组、DIO组及1% TFAs组，说明HO-1被激活，诱导抗氧化物质的表达，起到细胞保护作用。这表明TFAs可能引起了肥胖大鼠脑氧化应激的发生，激活了Nrf2和HO-1的表达。

4 结论

本研究结果表明，高含量TFAs可能引起肥胖大鼠脑和血液的抗氧化能力损伤，清除自由基能力下降，发生氧化应激和脂质过氧化，其作用机制可能与上调Nrf2和HO-1基因和蛋白水平的表达有关，导致组织损伤，最后引发相关疾病的发生。

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