优效电针干预不同病理痛的脊髓P2X3机制研究

沈科展 何淑峥 孙鑫 陈扬 朱雨鑫 杜俊英 方剑乔

摘要 目的：觀察优效电针干预对炎性痛和坐骨神经分支选择性损伤大鼠的镇痛作用及脊髓背角P2X3蛋白表达的影响。方法：实验分2部分：1）SD大鼠完全随机分为空白组、CFA组、100 Hz组和假电针组;2）SD大鼠完全随机分为假SNI组、SNI组、2 Hz组和假电针组。通过足底皮下注射完全弗氏佐剂建立炎性痛模型;通过结扎并切断左侧腓总神经和胫神经后远端，保留腓肠神经的方法建立坐骨神经分支选择性损伤模型。于造模后1 d，100 Hz或2 Hz电针足三里、昆仑穴，持续干预3 d。采用up and down方法检测机械缩足阈，采用免疫印迹法检测患侧脊髓背角P2X3蛋白表达。结果：1）与空白对照组比较，CFA组大鼠机械缩足阈造模后各个时间点都显著下降，CFA组大鼠脊髓背角P2X3蛋白表达增多;与CFA组比较，电针干预1次、3次均能显著提升机械缩足阈，电针干预3次能降低脊髓背角P2X3的蛋白表达，假电针无干预作用。2）与假SNI组比较，SNI组大鼠机械缩足阈造模后各个时间点都显著下降，SNI组大鼠脊髓背角P2X3蛋白表达增多;与SNI组比较，电针干预1次、3次均能显著提升机械缩足阈，电针干预3次能降低脊髓背角P2X3的蛋白表达，假电针无干预作用。结论：100 Hz电针可有效干预慢性炎性痛大鼠机械缩足阈，2 Hz电针可有效干预神经病理痛大鼠机械缩足阈;其镇痛作用可能与下调脊髓背角P2X3蛋白表达相关。

关键词 优效电针;干预;炎性痛;神经病理痛;脊髓;P2X3;机制;比较

Abstract Objective：To observe the analgesic effects of the optimal electroacupuncture intervention on the rats with inflammatory pain and sciatic nerve branch selective injury and the effect of spinal dorsal horn P2X3 protein expression.Methods：The experiment has two parts.Part I：SD rats were randomly divided into a blank group，a CFA group，a 100 Hz group and a sham electroacupuncture group.Part II：SD rats were completely randomly divided into a sham SNI group，SNI group，2 Hz group and sham electroacupuncture group.The model of inflammatory pain was established by subcutaneous injection of complete freund′s adjuvant.By ligating and cutting off the left common peroneal nerve and distal posterior tibial nerve，and preserving the sural nerve，a selective injury model of the sciatic nerve branch was established.At 1 d after molding，100 Hz or 2 Hz electroacupuncture at Zusanli（ST36）and Kunlun（BL60）acupoints continuous intervention for 3 d.the paw withdrawal thresholds was detected by up and down method，and the expression of P2X3 protein in the dorsal horn of the spinal cord on the affected side was detected by western blot.Results：Part I：Compared with the blank control group，the paw withdrawal thresholds in CFA group decreased significantly at all time points after modeling，while P2X3 protein expression in spinal dorsal horn of rats in CFA group increased.Compared with CFA group，electroacupuncture intervention once or three times can significantly improve the paw withdrawal thresholds，electroacupuncture intervention three times can reduce the spinal dorsal horn P2X3 protein expression，and sham electroacupuncture intervention has no effect.Part II：compared with the sham SNI group，the paw withdrawal thresholds were significantly decreased at all time points after modeling，and the P2X3 protein expression in the spinal dorsal horn of the service group was increased.Compared with the SNI group，1 and 3 times of electroacupuncture intervention could significantly improve the paw withdrawal thresholds，3 times of electroacupuncture intervention could reduce the protein expression of P2X3 in the spinal dorsal horn，and sham electroacupuncture intervention has no effects.Conclusion：One hundred Hz electroacupuncture can effectively interfere with the paw withdrawal thresholds of chronic inflammatory pain in rats.2 Hz electroacupuncture can effectively interfere with the paw withdrawal thresholds of neuropathologic pain in rats.Its analgesic effect may be related to down-regulating the expression of P2X3 protein in spinal dorsal horn.

Key Words Optimal electroacupuncture; Intervention; Inflammatory pain; Neuropathic pain; Spinal cord; P2X3; Mechanism; Comparison

中图分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.005

慢性疼痛仍然是当今社会急需解决的重大和重点问题。慢性疼痛主要包括慢性炎性痛和神经病理性痛。已有研究证明，慢性炎性痛和神经病理痛具有相似的发生机制。P2X3主要表达于DRG中小神经元细胞中，与慢性炎性痛和神经病理痛均密切相关。脊髓背角在疼痛传递中处于重要地位，已有研究报道，坐骨神经压迫损伤模型中，脊髓背角P2X3蛋白表达增多[1-2];但在慢性炎性痛模型中，脊髓背角P2X3蛋白表达是否变化，目前未见研究报道。

电针具有良好的镇痛作用，其镇痛效应与频率相关，我们前期和他人研究报道，100 Hz电针对炎性痛的干预作用最佳，2 Hz电针对神经病理痛的干预作用最佳[3-5]。电针对慢性炎性痛的镇痛效应与调控DRG水平的P2X3相关[6]。他人研究报道，电针对坐骨神经挤压损伤模型大鼠的镇痛作用与下调脊髓背角P2X3表达相关[2]。本研究中，我们拟建立完全弗氏佐剂诱导的慢性炎性痛模型和坐骨神经分支选择性损伤的神经病理痛模型，观察机械缩足阈和脊髓背角P2X3表达变化及电针的干预，比较电针对不同病理痛模型大鼠调控机制的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

清洁级SD大鼠，购自上海斯莱克公司，由浙江中医药大学实验动物中心饲养。实验过程中对动物的处理符合科技部2006年颁布的《有关善待实验动物的指导性意见》。实验动物分两批进行。

1.1.2 试剂与仪器

1）试剂：CFA（美国Sigma，F5881）;兔抗大鼠P2X3多克隆抗体（美国Abcam，ab10269）;辣根过氧化物酶标记的GAPDH（美国Cell Signaling，3683S）;山羊抗兔IgG H&L（HRP）（美国Abcam，ab6721）;BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，P0018）;其余试剂均为国产分析纯级。

2）仪器：Von Frey丝（美国stoelting公司）;恒温手术台（美国Harvard公司）;韩式穴位神经刺激仪（联创科技南京济生医疗科技有限公司）;超声波粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）;电泳-转印系统（美国Bio-Rad公司）;全能台式高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司）;Spectra Max M4酶标仪（美国美谷分子有限公司）;Image Quant LAS4000型凝胶成像系统（德国GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

1.2.1.1 分组

第一批：100 Hz电针对CFA大鼠脊髓P2X3表达的影响，完全随机分为空白组、CFA组、100 Hz组和假电针组;第二批：2 Hz电针对CFA大鼠脊髓P2X3表达的影响，完全随机分为假SNI组、SNI组、2 Hz组和假电针组。

1.2.1.2 模型制备

炎性痛模型制备：通过左侧足底皮下注射完全弗氏佐剂建立炎性痛模型。

坐骨神经分支选择性损伤模型制备：通过结扎并切断左侧腓总神经和胫神经后远端，保留腓肠神经的方法建立神经病理痛模型。

1.2.2 干预方法

电针组：于造模后1 d检测完行为学介入电针干预。用0.18 mm×13 mm毫针刺入双侧“足三里”“昆仑”穴，韩式电针仪器连接，干预参数：100 Hz或2 Hz，强度先0.5 mA，每10 min增加0.5 mA，共干预30 min，1次/d。

假电针组：与电针组选取相同的穴位，仅刺入皮下，接电针，不开通电源。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 机械缩足阈

采用up and down方法检测机械缩足阈[7]。Von frey丝0.4 g、0.6 g、1.0 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、15.0 g、26 g。从4.0 g开始，将von-Frey丝垂直刺向大鼠左侧大鼠足底中央（炎性痛）或足底外侧（神经病理痛），完成S形，持续6～8 s。若大鼠出现缩足或添足等反应时为阳性，记X，换邻近的大一号von-frey丝刺激;反之记O，换邻近的小一号von-frey丝刺激。当出现第一个OX或XO时，再测量4次。以（10[Xf+]）/10 000的公式计算机械缩足阈。其中为0.231，Xf为最后一根von-frey丝的对数值，为OX序列查表得出。

1.2.3.2 免疫印迹法检测患侧脊髓背角P2X3蛋白的表达

实验大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，生理研究经心脏灌注直至流出液体為澄清液体，快速取出患侧L4～6脊髓背角，-80 ℃保存备用。各组脊髓背角组织加入预冷的RIPA裂解液混合液（包括蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等），冰浴超声粉碎，静置0.5 h后离心取上清液测量蛋白浓度。15 g上样量用10%SDS-PAGE分离胶、5%SDS-PAGE浓缩胶电泳。电泳后半干转印至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温孵育，兔抗大鼠P2X3和兔抗大鼠GAPDH孵育，HRP标记的二抗孵育，ECL反应5 min，ImageQuant LAS4000凝胶成像拍片，Image Quant TL软件分析。

1.3 统计学方法

实验数据采用均数标准误，以SPSS 22.0统计软件处理。采用单因素方差分析;组间两两比较，方差齐性时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett′s T3检验;均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 100 Hz电针干预对炎性痛大鼠机械縮足阈的影响

结果如图1所示，造模前，各组大鼠基础机械缩足阈无统计学意义，具有可比性（P>0.05）。造模后24 h，电针干预前，CFA组、100 Hz组和假电针组大鼠患侧机械缩足阈显著下降（P<0.01）。100 Hz电针干预1次和3次均能显著提高大鼠患侧机械缩足阈（P<0.01），假电针无此作用（P>0.05）。

2.2 2 Hz电针干预对坐骨神经分支选择性损伤大鼠机械缩足阈的影响

结果如图2所示，造模前，各组大鼠基础机械缩足阈无统计学意义，具有可比性（P>0.05）。造模后24 h，电针干预前，SNI组、2 Hz组和假电针组大鼠患侧机械缩足阈显著下降（P<0.01）。2 Hz电针干预1次和3次均能显著提高大鼠患侧机械缩足阈（P<0.01），假电针无此作用（P>0.05）。

2.3 100 Hz电针干预对慢性炎性痛大鼠脊髓背角P2X3蛋白表达的影响

结果如图3所示，与空白组大鼠比较，CFA组大鼠患侧脊髓背角P2X3蛋白表达明显增多（P<0.01）。与CFA组大鼠比较，100 Hz电针组大鼠患侧脊髓背角P2X3蛋白表达显著减少（P<0.01），假电针组大鼠患侧脊髓背角P2X3蛋白表达无明显变化（P>0.05）。

2.4 2 Hz电针干预对坐骨神经分支选择性损伤大鼠脊髓背角P2X3表达的影响

结果如图4所示，与假SNI组大鼠比较，SNI组大鼠患侧脊髓背角P2X3蛋白表达明显增多（P<0.01）。与SNI组大鼠比较，2 Hz和100 Hz电针组大鼠患侧脊髓背角P2X3蛋白表达显著减少（P<0.01），假电针组大鼠患侧脊髓背角P2X3蛋白表达无明显变化（P>0.05）。

3 讨论

慢性疼痛包括慢性炎性痛和神经病理痛。足底皮下注射完全弗氏佐剂建立的慢性炎性痛模型具有操作简单、模型稳定、机械痛和热痛下降明显、持续时间较长的特点，常用于慢性炎性疼痛的机制及干预研究[8]。坐骨神经分支选择性损伤模型（SNI）是比较新的神经病理痛模型，具有机械痛下降、热痛不变、持续时间长、可重复性高的特点[9]。本次实验中我们采用的是完全弗氏佐剂模型和SNI模型进行研究。

电针对慢性炎性痛和神经病理痛均具有良好的镇痛作用。频率是电针刺激的重要参数之一，不同频率可通过调节不同物质从而发挥不同的干预效应[10]。韩济生院士等认为低频电针干预可促进中枢内啡肽、脑啡肽、内吗啡肽释放增加，高频电针干预可促进强啡肽释放[11]。不同频率对不同疼痛的镇痛效应不同;在神经病理痛中，周杰等采用不同频率电针对脊神经结扎模型大鼠进行干预，发现在神经病理痛早期，100 Hz电针的镇痛疗效较2 Hz佳，在神经病理痛慢性，2 Hz电针的镇痛疗效较100 Hz佳[5]。侯丽萍等通过建立坐骨神经压迫损伤大鼠模型，采用2 Hz和100 Hz进行干预，观察到2 Hz和100 Hz电针干预均能显著减轻神经病理痛大鼠热痛和机械痛[12]。亦有研究报道，在L5/L6脊神经结扎模型中，2 Hz和100 Hz电针干预均能改善疼痛，但2 Hz镇痛效应强于100 Hz[13];在慢性炎性痛中，蒋袁絮等[14]认为，在弗氏佐剂诱导的慢性炎性痛中，不论在缓解关节肿胀还是缓解疼痛，100 Hz电针干预作用均优于2 Hz。项璇儿等[15]研究报道，2 Hz、100 Hz、2/100 Hz均能提升弗氏完全佐剂诱导大鼠的机械痛阈和热痛阈。我们本次研究中，分别用100 Hz电针和2 Hz电针对弗氏佐剂大鼠和坐骨神经分离损伤大鼠进行干预，观察到，100 Hz电针可减轻炎性痛、2 Hz电针可减少神经病理痛。

P2X3高度表达于背根神经节，与疼痛的形成和发展密切相关。近年来，研究人员观察到，脊髓背角的P2X3高表达与神经病理痛的形成有关，如王玉洁[16]等研究报道，坐骨神经慢性压迫模型大鼠脊髓背角P2X3阳性细胞表达增多。王金金等[2]亦观察到相似的结果。赵文宇等等[17]发现，在坐骨神经慢性压迫模型大鼠中，脊髓背角P2X3mRNA表达增多。本次研究中，我们观察到不论是完全弗氏佐剂大鼠还是坐骨神经分支选择性损伤大鼠，脊髓背角P2X3蛋白表达均增多。

大量研究报道，电针镇痛机制，除了促进中枢阿片肽释放外，还可能有其他机制[20-21]。本次研究中，我们观察到，100 Hz电针可显著降低完全弗氏佐剂诱导大鼠脊髓背角P2X3蛋白表达，2 Hz电针可明显减少坐骨神经分支选择性损伤大鼠脊髓背角P2X3蛋白表达。因此，我们认为，电针可有效干预慢性炎性痛和神经病理痛，其镇痛作用可能与下调脊髓背角P2X3蛋白表达相关。

参考文献

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（2019-05-10收稿 责任编辑：徐颖）