高效液相色谱法测定丹红注射液中成分的含量

都姣娇 屈相玲 张琪

摘要 目的：通過高效液相色谱法测定丹红注射液中有效成分丹酚酸羟基红花黄色素A（以下简称丹酚酸A）、丹酚酸B、丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸和迷迭香酸的含量。方法：色谱条件采用C18色谱柱（型号为Eclipse XDB），该色谱柱的长度为250 mm，色谱柱内经为4.6 mm，色谱柱填料颗粒直径为5 μm。进样量为10 μL，流动相采用乙腈（A相）和0.1%磷酸水溶液（B相）的二元体系进行梯度洗脱。高效液相应用于药物成分分析中，因为高效液相系统中的DAD检测器可在色谱分析过程中自动记录色谱峰对应组分和对应波长的光谱图，本研究采用双光束紫外可见分光光度计检测6种对照品以确定检测波长。高效液相色谱法方法严谨性考察，包括线性关系、精密度、重复性、稳定性和加样回收试验考察，基于高效液相色谱法方法具有严谨性的前提下，对丹红注射液中成分的含量进行测定。结果：1）本研究采用双光束紫外可见分光光度计检测6种对照品的紫外-可见光谱分析确定检测波长为280 nm可测定丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A这4种成分;而检测波长为330 nm可测定咖啡酸、迷迭香酸这2种成分。2）线性考察结果显示回归方程、相关系数和线性范围分别是：丹酚酸A：Y=1.62X+7.69、0.999 9、33.62～3 362.00 μg/mL;丹酚酸B：Y=84.31X+18.84、0.999 8、2.21～2 210.00 μg/mL;丹参素钠：Y=37.40X+696.08、0.999 1、11.78～1 178.00 μg/mL;原儿茶醛：Y=203.45X+21.02、0.999 9、1.01～101.00 μg/mL;咖啡酸：Y=11.84.53X+2.48、0.999 7、0.05～5.10 μg/mL;迷迭香酸：Y=203.04X+65.93、0.999 9、1.08～108.00 μg/mL。3）加样回收试验结果显示丹酚酸A对照品溶液、丹酚酸B对照品溶液、丹参素钠对照品溶液、原儿茶醛对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、迷迭香酸对照品溶液平均回收率分别为100.20%、101.03%、99.01%、100.87%、100.43%、98.74%，RSD分别为1.29%、1.65%、1.29%、1.035%、1.32%、1.84%，提示高相液相检测方法所测加样回收率结果可靠。4）混合对照品溶液和丹红注射液供试品溶液的HPLC色谱图可见丹红注射液供试品溶液中6种成分与其他共存峰均得到很好的分离，3个不同批次的丹红注射液中成分含量均存在不同程度的差异。结论：高效液相色谱法的操作简单，结果具有较好的精密度、稳定性和重复性，可作为丹红注射液质量控制的有效方法，而不同批次丹红注射液中有效成分含量存在不同程度差异。

关键词 高效液相色谱法;丹红注射液;丹酚酸A;丹酚酸B;丹参素钠;原儿茶醛;咖啡酸;迷迭香酸

Abstract Objective：To determine the content of salvianolic acid hydroxy safflower yellow A（salvianolic acid A），salvianolic acid B，salvianolic acid sodium，protocatechuic aldehyde，caffeic acid and rosmarinic acid in Danhong injection by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：The chromatographic conditions were determined by C18 column（type Eclipse XDB）.The length of the column was 250 mm，the diameter of the packing particles in the column was 5 micron，and the inner diameter of the column was 4.6 mm.A binary system of acetonitrile（A phase）and 0.1% phosphoric acid aqueous solution（B phase）was used for gradient elution.HPLC was applied to the analysis of pharmaceutical components.The DAD detector in the HPLC system can automatically record the spectra of the corresponding components and wavelengths of chromatographic peaks in the process of chromatographic analysis.The method of HPLC was rigorous，including linear relationship，precision，repeatability，stability and sample recovery.Based on the rigorous method，the content of Danhong injection was determined.Results：1）The UV-Vis spectrophotometer was used to detect 6 reference substances，and the detection wavelength was 280 nm，which could be used to determine salvianolic acid sodium，protocatechuic aldehyde，salvianolic acid B and salvianolic acid A，while the detection wavelength was 330 nm，which could be used to determine caffeic acid and rosmarinic acid.2）Linear regression equation，correlation coefficient and linear range were：salvianolic acid A：Y=1.62X+7.69，0.999 9，33.62～3 362.00 μg/mL; salvianolic acid B：Y=84.31X+18.84，0.999 8，2.21～2 210.00 μg/mL; salvianolic acid sodium：Y=37.40X+696.08，0.999 1，11.78～1 178.00 μg/mL; protocatechuic aldehyde：203.45X+21.02 μg/mL; Caffeic acid：Y=11.84.53X+2.48，0.999 7，0.05～5.10 μg/mL; rosmarinic acid：Y=203.04X+65.93，0.999 9，1.08～108.00 μg/mL.3）The average recoveries of salvianolic acid A，salvianolic acid B，salvianolic acid sodium，protocatechuic aldehyde，caffeic acid and rosmarinic acid were 100.20%，101.03%，99.01%，100.87%，100.43%，98.74% and RSD respectively.The recoveries of the samples were 1.29%，1.65%，1.29%，1.035%，1.32% and 1.84% respectively，which indicated that the method of HPLC was reliable.4）The HPLC chromatograms of mixed reference solution and Danhong injection solution showed that the six components in Danhong injection solution were well separated from other coexisting peaks，and the contents of components in 3 different batches of Danhong injection were different in varying degrees.Conclusion：HPLC is a simple，accurate，stable and reproducible method for the quality control of Danhong injection.The contents of active ingredients in different batches of Danhong injection are different.

Key Words High performance liquid chromatography; Danhong injection; Salvianolic acid A; Salvianolic acid B; Sodium salvianolate; Protocatechuic aldehyde; Caffeic acid; Rosmarinic acid

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.006

丹红注射液是由中药丹参、红花采用现代中药制药提取工艺制作而成的中药复方注射液，现代药理研究显示[1-2]，丹红注射液中包含丹参素钠、原儿茶醛、尿苷、腺苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸羟基红花黄色素A（以下简称丹酚酸A）等有效成分，故其具有活血化瘀，理气通脉的功效，从而起到改善心肌缺血[3]、抑制动脉粥样硬化[4]，抗血小板凝聚[5]、改善微小循环功能[6]等作用，临床上常用于冠心病、心绞痛、心梗，缺血性脑卒中等瘀血闭阻所致诸证[7-9]。虽然丹红注射液在临床上已经使用多年，且疗效良好，但是对其药物的有效成分进行定量分析的研究仍较少，未能有效的建立一个中药质量评定方法，不利于本品的产品质量控制。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是目前在中药成分研究领域中最为广泛使用的分析方法之一，其具有应用范围广、检测分析快、药物分离、检出灵敏度高、操作自动简便等优点[10-11]，本研究使用HPLC对丹红注射液的各主要成分含量进行测定，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent高效液相（型号：1200型），其中该色谱系统还包括以下主要适配零件和系统，如二极管阵列DAD检测器（型号：G1315D型）、四元梯度泵（型号：G1311A型）、柱温箱（型号：G1316A型）、在线脱气机和化学工作站（型号：G1322A型）。购买于上海精密仪器仪表公司的电子分析天平（型号：FA1004N型）和超声波清洗器（型号：KQ-100DE）;购买于法国MILIPORE公司的超纯水系统（型号：Mili-RO Plus型），上海科导超声仪器有限公司;双光束紫外可见分光光度计（型号：MQK-UV1800型）购买于上海米青科实业有限公司。

1.2 试药 于北京谱析科技有限公司和中国药品生物制品检定所购买丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品、咖啡酸对照品、迷迭香酸对照品、芦丁对照品、丹酚酸B对照品、丹酚酸A对照品，批号分别为110855-200809、110810-201007、20120211、111871-201102、100080-200707、20110822、20120207。于美国Fisher公司购买色谱纯乙腈和甲醇，批号分别为：102489、101437。于上海拓国沪试实验室器材股份有限公司购买的磷酸分析纯（AR级，批号：20170412）。

1.3 分析药品 丹红注射液（山东丹红制药有限公司，国药准字Z20026866，规格10 mL/支），选择110934、110926和111042 3个不同批次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用C18色谱柱（型号为Eclipse XDB），该色谱柱的长度为250 mm，色谱柱内经为4.6 mm，色谱柱填料颗粒直径为5 μm。进样量为10 μL，流动相采用乙腈（A相）和0.1%磷酸水溶液（B相）的二元体系进行梯度洗脱，具体的梯度洗脱程序和流速见表1。

2.2 对照品溶液配制 取6个5 mL量瓶，每一个量瓶依次精密称取5.60 mg丹酚酸A对照品6.55 mg、10.95 mg丹酚酸B对照品、丹参素钠对照品、5.05 mg原儿茶醛对照品、1.55 mg咖啡酸对照品、5.45 mg迷迭香酸对照品，加超纯水稀释至刻度定容，摇晃混合充分溶解和混匀，分别配制出3.36 mg/mL丹酚酸A对照品溶液、0.22 mg/mL丹酚酸B对照品溶液、1.31 mg/mL丹参素钠对照品溶液、0.10 mg/mL原儿茶醛对照品溶液、0.11 mg/mL迷迭香酸对照品溶液、0.004 mg/mL咖啡酸对照品溶液，取50 mL容量瓶充分混合均匀上述6种对照品溶液，获得混合对照品溶液，于4 ℃冰箱内冷藏备用。

2.3 供试品溶液配制 采用无菌注射器精密吸取2 mL丹红注射液并置10 mL量瓶中，加超纯水稀释至刻度定容，充分混合均匀后经0.45 μm滤膜滤过，即得丹红注射液供试品溶液。

2.4 检测波长的确定 高效液相应用于药物成分分析中，需要根据对照品确定检测波长为多少，需要设置1个检测波长还是2个检测波长，因为高效液相系统中的DAD检测器可在色谱分析过程中自动记录色谱峰对应组分和对应波长的光谱图，本研究采用雙光束紫外可见分光光度计检测6种对照品的紫外-可见光谱分析确定检测波长为280 nm可测定丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹酚酸A这4种成分;而检测波长为330 nm可测定咖啡酸、迷迭香酸这2种成分。见图1。

2.5 线性关系考察 分别精密量取1 mL混合对照品溶液于5个不同刻度量瓶中，以超纯水稀释1.25、5、10、20、100倍。精密量取10 μL上述5种稀释混合对照品溶液和原混合对照品溶液进行高效液相分析，记录色谱图和峰面积，纵坐标（Y）是各对照品色谱峰的峰面积，横坐标（X）是各对照品浓度（μg/mL），线性回归后计算得标准曲线的回归方程和相关系数。见表2。

2.6 精密度试验 精密取同一2.3制备的供试品溶液10 μL，在一组相同的测量程序、相同测试地点和相同的色谱条件等情况下，连续重复测量6次HPLC检测，且各色谱峰相对峰面积的RSD<3%，精密度结果最终取大于总峰面积5%的色谱峰相对峰面积RSD平均值1.831%，研究结果显示丹红注射液供试品溶液精密度良好。

2.7 稳定性试验 由于固定相的有限稳定性，为确保每一次研究之间的结果误差最小，进行指纹图谱对比研究之前，取同一批号供试品溶液以确定供试品溶液的稳定性，分别室温放置0、4、8、16、24 h后进行HPLC检测，各色谱峰相对峰面积的RSD<3%则说明稳定性良好，本研究稳定性结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.861%，提示丹红注射液供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 为确保研究的客观性，进行指纹图谱对比研究之前，需要进行短时间内的HPLC连续重复性测试，精密量取6份同一批号供试品溶液，进样量10 μL，连续进样，各色谱峰相对峰面积的RSD<3%表示重复性良好，本研究结果显示色谱峰相对峰面积RSD平均值1.918%，提示丹红注射液的重复性良好。

2.9 回收率试验 精密吸取已知含量的丹红注射液供试品溶液6份，每份均为1 mL，分别置于10 mL容量瓶中，每一份均精密加入等量已知浓度的3.36 mg/mL丹酚酸A对照品溶液、0.22 mg/mL丹酚酸B对照品溶液、1.31 mg/mL丹参素钠对照品溶液、0.10 mg/mL原儿茶醛对照品溶液、0.11 mg/mL迷迭香酸对照品溶液、0.004 mg/mL咖啡酸对照品溶液，加入超纯水稀释至刻度定容混合均匀后，进行加样回收试验的检测，根据2.1的色谱条件进行检测并计算加样回收率。结果显示丹酚酸A对照品溶液、丹酚酸B对照品溶液、丹参素钠对照品溶液、原儿茶醛对照品溶液、咖啡酸对照品溶液、迷迭香酸对照品溶液平均回收率分别为100.20%、101.03%、99.01%、100.87%、100.43%、98.74%，RSD分别为1.29%、1.65%、1.29%、1.035%、1.32%、1.84%，提示高相液相检测方法所测加样回收率结果可靠。见表5。

2.10 样品检测结果

2.10.1 丹红注射液的HPLC色谱图 在2.1色谱条件下进行的高效液相法测定，从图2混合对照品溶液和丹红注射液供试品溶液的HPLC色谱图可见丹红注射液供试品溶液中6种成分与其他共存峰均得到很好的分离。

2.10.2 丹红注射液中成分的含量 取110934、110926、和111042等3个不同批次号的丹红注射液，根据2.2供试品溶液配制，每批样品都根据2.1的色谱条件进行重复测试3次，丹红注射液中成分的含量取3次测定的平均值，结果显示如表6所示，3个不同批次的丹红注射液中成分含量均存在不同程度的差异。

3 讨论

丹红注射液在临床上常用于治疗瘀血闭阻所致的心脑血管疾病，如冠心病、心梗、心绞痛、缺血性脑卒中、瘀血型肺心病等，其药物的主要活性成分为核苷、腺苷及丹酚酸類成分。根据研究表明，核苷类成分为构成生物细胞活动的基础[12];腺苷则可通过一种特异性的受体，从而增强心肌能量、减轻自由基的损害、增加再灌注量而起到保护心脏的作用[13];丹酚酸类的成分（丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A）大部分都结构相似，都可抑制细胞膜的脂质过氧化损伤，同时清除氧自由基，起到保护细胞及抑制血管的粥样硬化[14-17]。本研究通过使用高效液相色谱法分析丹红注射液中的相关有效成分，并进行定量分析，从而实现对药物的质量管控。

从波长的选择角度分析发现在研究过程中，在对丹参注射液中丹参素钠、丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸、咖啡酸等主要有效成分进行分析，为了最大限度和更加准确灵敏的测量出各成分的确切含量，在通过扫描后的综合分析，成分考虑后，选择以280 nm及330 nm为检测波长。

从样品的稳定性角度分析发现在测定过程中发现，丹参注射液中丹参素钠、丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛、迷迭香酸、咖啡酸等主要有效成分在常规缓解下，成分均容易发生变化，特别是在温度较高的非密闭的环境下时，均具有极强的还原性，极易对药物分析产生误差[18-19]。

从流动相的选择角度分析发现6种有效成分中，丹参素钠与丹酚酸A极性相差较大，出峰的时间间隔相差的比较远，为了能采用同一高效液相色谱系统的同一流动相条件下同时测定6种成分，同时尽量缩短出峰时间，因此本研究采用了梯度洗脱的模式[20]。如果在甲醇-0.05%磷酸水溶液作为流动相的情况下，以本研究的梯度洗脱程序进行高效液相色谱法检测，发现原儿茶醛和丹酚酸B的色谱峰附近均有其他干扰峰，两者都无法与其他有效成分达到基线分离;后期研究摸索改用乙腈作为流动相能获得较好的基线分离效果。在进一步的研究中发现，由于丹红注射液中为酚酸类成分较多，流动相的pH会影响峰形造成拖尾现象;因此在通过考察流动相中的磷酸比例进行调整，结果发现色谱峰的对称性在一定范围内随着磷酸比例而增加，减少了色谱峰的拖尾现象。最终选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相系统，各色谱峰峰形良好，各有效成分的分离情况也能获得理想的分离。

在对具有多种有效成分，且相互间可发生直接影响的丹红注射液来说，检测药物有效成分是，单一的对一种成分或少数几个有效成分进行检测，仍不足以较为全面的体现出丹红注射液的质量控制效果，故而本研究结合检测多种有效成分，更为全面地反映丹红注射液的质量评价，以期为丹红注射液的质量控制及药理研究工作提供相关思路。

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（2018-10-28收稿 责任编辑：王明）