UV-B辐射对神农香菊萜类物质合成及其相关基因表达的影响

何淼 王霁佳 高文杰 刘洋 周蕴薇

摘 要： 该研究以神农香菊为材料，用强度为400 μw·cm-2的紫外光UV-B对其进行辐射处理，辐射时间分别为0、0.5、1、2、4 h，探讨了UV-B辐射对神农香菊萜类物质合成及其相关基因表达的影响。结果表明：（1）较短时间的UV-B辐射对神农香菊萜类物质合成相关基因表达量有明显的促进作用。与对照相比，0.5、1、2、4 h处理对相关基因表达量均有不同程度的提高;在2 h处理下HMGR、DXR、TPS、GPS基因的相对表达量达到最大值，在4 h处理下FPS和DXS的相对表达量达到最大值，其中FPS基因表达量变化最显著，为对照的69倍。（2）MVA途径中，去氢白菖烯、杜松萜烯的含量与FPS基因表达量4 h内持续上升的变化趋势保持一致，1-石竹烯与HMGR的变化趋势保持一致，表现为先升高后降低。（3）MEP合成途径中，α-侧柏酮、崖柏酮、β-侧柏酮的含量呈现与DXR、GPS、TPS基因表达量相同的变化趋势，桉树脑在UV-B辐射4 h内持续上升，与DXS基因的变化一致。由此可以推断，UV-B辐射通过影响各自途径中一些关键基因的表达量，进而影响了神农香菊萜类物质的合成量。

关键词： 神农香菊， UV-B辐射， 萜类物质， 基因表达

中图分类号： S682.1  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2019）07-0933-07

Abstract： In this study， Chrysanthemum indicum var. aromaticum was used as material. We examined the changes of biosynthesis of terpenoid and expression of related genes in C. indicum var. aromaticum following the treatment of different durations （0， 0.5， 1， 2， 4 h） of 400 μw·cm-2 UV-B radiation. The results were as follows： （1） The short time of UV-B radiation could significantly promote the expression of related genes in C. indicum var. aromaticum. Compared with the control， 0.5， 1， 2， 4 h treatment of UV-B radiation increased the expression of related genes. Meanwhile， relative expressions of HMGR， DXR， TPS， GPS reached the peak after two hours’ treatment of UV-B radiation. As well as the relative expressions of FPS and DXS reached the maximum at four hours’ treatment. A significant increase in FPS gene expression was found when plant exposed to four hours of UV-B duration （69 times compared with control）. （2） In mevalonate pathway（MVA）， the contents of calamenene， cadinene increased following the change of FPS gene expression during four hours of UV-B radiation. The change of the content of 1-caryophyllene was consistent with the change of HMGR gene expression， which increased first and then decreased. （3） In the pathway of 2-methyl-D-erythritol-4-phosphate （MEP）， the contents of α-thujone， thujone and β-thujone showed the same trend as the expressions of DXR， TPS and GPS. The content of cajuputole generally increased during four hours’ treatment responding to the change of DXS gene expression. In summary， the data indicate that UV-B radiation can change the regulation of terpenoid biosynthesis in C. indicum var. aromaticum by affecting some key genes’ expressions.

Key words： Chrysanthemum indicum var. aromaticum， UV-B radiation， terpenoid， gene expression

神農香菊（Chrysanthemum indicum var. aromaticum）是菊科菊属植物，分布于湖北神农架地区（刘启宏和张树藩，1983），有清热解毒、杀菌消炎、平肝明目、散风降压的功效（刘启红等，1986）。神农香菊全株都具有特殊的香气，因此成为菊科菊属中重要的芳香型观赏花卉。神农香菊这种自然香气在菊科植物中十分罕见，不仅具有广阔的园林应用前景，而且对研发具有浓香型菊科新品种具有重要的意义。在我们课题组前期的研究中已经发现神农香菊叶片、花瓣表面均密被腺毛。神农香菊植株的香气与腺毛分泌物中的萜烯类等化合物有密切关系（何淼等，2015），而与萜类化合物合成相关的基因可以有效调控植物体内的萜类化合物的种类和含量。

萜类化合物是指由不同数量的异戊二稀（C5H8）单元所组成的化合物及其衍生物。目前已经发现了两条主要的萜类物质生物合成途径，甲羟戊酸途径（mevalonate pathway， MVA）和甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（methylerythritol-4-phosphate pathway， MEP ）（Dudareva et al.， 2005）。植物萜类化合物生物合成途径中的相关酶种类多种多样，酶基因不仅决定了后续反应中合成萜类产物的种类，还对产物积累的量具有重要调控作用。目前研究较多的有位于MVA 途径中的HMGR、FPS等（Chappell， 1995;嵇保中等，2007），以及位于MEP途径的DXS、DXR、GPS等（Malhotra et al.， 2014;张玲等，2013）。而TPS同时位于两种途径的下游，催化底物生成单萜、倍半萜或二萜（Martin et al.， 2012）。这些关键酶基因可以催化形成萜类化合物的各种前体以及中间体（唐亮等，2014），它们位于合成途径的重要分支点或者在产物形成的下游位置。若是能通过生物学手段来调节这些关键酶基因在植物体内的相对表达量，就可以不断地来提高相关萜类物质的产量。植物萜类化合物的合成在受植物不同发育阶段影响的同时，昆虫、病原菌等生物以及光照、温度、湿度等非生物因子也对植物萜类的生物合成产生影响（梁宗锁等，2017）。在光生态因子中，UV-B辐射是极其重要的一类，它能直接或间接影响植物的形态、生物量、光合作用、生理代谢、蛋白质和核酸等，从而影响植物的生长发育（蒲晓宏等，2017）。受UV-B辐射后一些植物的基因表达、酶活性及次生代谢均会发生变化（Searles et al.， 2001）。

本研究利用紫外线UV-B对引种于湖北神农架地区的神农香菊进行辐射处理，采用GC/MS和qRT-PCR技术对不同辐射时间下的神农香菊叶片萜类物质及其相关基因进行检测分析，初步从UV-B辐射对神农香菊萜类物质合成及其相关基因表达方面进行相关影响的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

神农香菊引自湖北神农架地区（110°23′57″ E， 31°28′07″ N），并成功培育于东北林业大学园林学院苗圃内。2017年5月选取长势整齐一致的神农香菊健壮茎尖进行扦插，待扦插苗生根后，换土上盆，在东北林业大学园林学院温室中培养。植株培养35 d左右，待长出7～8片功能叶时，取生长健壮、整齐一致、无病虫害的植株进行试验。

1.2 方法

1.2.1 UV-B辐射处理 选择长势一致的神农香菊植株，用UV-B 紫外灯（南京华强电子有限公司）进行辐射处理。以植株上数第3片功能叶辐射强度为400 μw·cm-2（由深圳欣宝瑞仪器有限公司生产的UV340B紫外线辐照计测定）设置UV-B 紫外灯辐射强度。将用于试验的神农香菊植株分为5个组，每组5棵，3次重复。分别辐射0、0.5、1、2、4 h。在5个不同UV-B辐射时间内取样，5个分组各取3 g植株的第3片功能叶片（12～15片叶），使用液氮速冻保存到-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 神农香菊萜类物质合成相关基因分析 按照TRNzoI Universal总RNA提取试剂（TIANGEN）说明书提取不同处理后神农香菊叶片总RNA，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反转录试剂盒合成cDNA，样品保存于-20 ℃冰箱。依据神农香菊转录组数据中 HMGR、DXR、TPS、GPS、FPS、DXS基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计相应引物。根据荧光定量试剂盒（TransStart Top Green qPCRSuperMix）以CmEF1α为内参基因进行荧光定量PCR，每个样品做3个重复。用于qRT-PCR检测的引物序列见表1。利用公式2-△△Ct进行基因相对表达量的计算（Livak & Schmittgen， 2001）。

1.2.3 神农香菊叶片萜类物质提取与分析 将保存于-80 ℃冰箱的神农香菊叶片材料放入研钵中充分研磨至粉末状，先后在3个装有100 mL二氯甲烷的燒杯中浸提，分别浸提3次，每次浸提2 s，用装有20 g无水硫酸钠的漏斗将浸提液过滤至圆底烧瓶中，接着置于旋转蒸发仪中40 ℃浓缩，随后将浓缩液移至棕色进样瓶中，并定容至0.5 mL，保存于0 ℃冰箱中备用（Hu et al.， 2012）。

采用GC-MS气质联用仪（美国Hewlett-Packard公司）对叶片表面分泌物进行分析。GC条件：色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱;进样量1 μL;分流比5∶1;程序升温，首先设定50 ℃时间30 min，随后以5 ℃·min-1的速率升温至160 ℃，最终设定温度升高的速率为10 ℃·min-1，升至270 ℃，溶剂延迟时间设为3.5 min。MS条件：以EI源为电离方式，设置仪器四极杆的温度为150 ℃，离子源的温度为230 ℃，接口的温度为280 ℃，电离能量设为70 eV，电子倍增器的电压设置2 100 V，扫描范畴（m/z）4～500，标准质谱图库NIST08L。

鉴定方法：采用Turbo Mass 5.4.2 GC/MS软件对神农香菊的萜类物质进行分析。利用峰面积归一法对每种组分的相对含量进行计算。

1.3 数据处理与分析

所得数据使用SPASS17.0进行相关性分析，采用Excel 2003进行计算和绘制图表。

2 结果与分析

2.1 UV-B辐射对神农香菊萜类物质合成相关基因表达量的影响

以神农香菊CmEF1α为内参基因，在UV-B辐射4 h内采用qRT-PCR技术对HMGR、DXR、TPS、GPS、FPS、DXS的表达强度情况进行检测，图1至图4的结果显示如下：随着UV-B辐射处理时间的延长，HMGR、DXR、TPS、GPS基因表达量先升高后降低。HMGR、DXR、TPS、GPS基因表达量在UV-B辐射期间的前0～1 h平稳增长，在辐射的第2小时相对表达量出现明显升高，均达到辐射处理期间的最大值，对比0 h的相对表达量差异性显著，变化幅度也最高，但在随后的第4小时却出现明显下降趋势。

FPS和DXS的相对表达量在UV-B辐射处理期间出现明显变化（图5，图6），具体表现为FPS基因的相对表达量在0.5 h内急剧上升后在2 h内变化较小，相对表达量在第4小时达到最大值，此时FPS基因的相对表达量较UV-B辐射处理0 h有显著性差异，总体上呈现一直上升的趋势;DXS基因的相对表达量在0.5 h内变化不明显，在第1小时和第2小时内上升迅速，在第4小时达到最大值，这时DXS基因的相对表达量较0 h有显著性差异，总体上呈现一直上升的趋势。FPS和DXS的相对表达量在UV-B辐射处理期间随着时间的延长而一直上升，在第4小时时达到最大值。其中FPS基因表达量变化最显著，在4 h为对照的69倍。

2.2 UV-B辐射对神农香菊萜类物质合成的影响

MVA途径参与植物萜类物质中倍半萜、三萜及多萜合成，而MEP途径参与单萜、二萜和四萜的生物合成。本研究主要研究位于MVA合成途径的倍半萜α-荜澄茄油烯、1-石竹烯、去氢白菖烯、杜松萜烯和位于MEP合成途径的单萜桉树脑、左旋樟脑、α-侧柏酮、崖柏酮和β-侧柏酮。对HMGR、DXR、TPS、GPS、FPS、DXS表达量进行分析后，本研究选择变化较显著的2 h和4 h进行神农香菊次生代谢产物中的萜类物质合成量的检测。

由表2可知，位于MVA合成途径的烯萜类物质的相对含量随着UV-B辐射时间的延长呈现不同趋势的变化。α-荜澄茄油烯呈现先降低后升高的变化趋势，在0、2、4 h的相对含量分别为17.04%、15.37%、18.05%;1-石竹烯呈先显著增加后再减少的趋势，0、2、4 h的相对含量分别为2.61%、28.36%、21.32%。去氢白菖烯和杜松萜烯呈持续增长的趋势。去氢白菖烯在0、2、4 h的相对含量分别为4.51%、5.32%、7.97%;杜松萜烯在0、2、4 h的相對含量分别为0.7%、1.65%、3.16%。

随着UV-B辐射时间的延长，位于MEP合成途径的樟脑类桉树脑的相对百分含量呈持续升高的趋势，其0、2、4 h分别为4.76%、5.93%、10.63%;左旋樟脑的相对含量呈持续降低的趋势，在0、2、4 h分别为6.04%、4.1%、2.1%。

MEP合成途径中醇酮类物质α-侧柏酮、崖柏酮和β-侧柏酮的相对百分含量随着UV-B辐射时间的延长呈现先升高后降低的趋势，除α-侧柏酮外4 h时的相对含量均高于0 h。α-侧柏酮在处理0、2、4 h时的相对含量分别为1.9%、2.63%、1.31%;崖柏酮在0、2、4 h时的相对含量分别为0.68%、1.01%、0.97%;β-侧柏酮在0、2、4 h时的相对含量分别为6.34%、10.36%、8.36%。

3 讨论

UV-B辐射对植物的遗传物质造成影响，包括对植物基因表达的影响（Hartmann et al.， 1998;Safrany et al.， 2008）。Dolzhenko et al.（2010）研究发现UV-B辐射会改变胡椒薄荷（Mentha piperita）萜类物质生物合成基因的表达。本研究同样也发现UV-B辐射对神农香菊萜类物质合成相关基因HMGR、DXR、TPS、GPS、FPS、DXS的表达量均产生影响，并且不同的UV-B辐射时间对基因表达量产生不同程度的影响（齐艳等，2014）。MVA途径中HMGR基因的表达量在UV-B辐射4 h内先升高后降低，而FPS持续上升。MEP途径中的DXR、GPS和TPS基因在处理期间先升高后降低，DXS却持续上升。根据这一结果推测UV-B辐射对分属于同一途径不同基因的表达量产生的影响也不完全相同。

植物次生代谢产物的合成主要受合成途径中的一系列合成酶的活性和基因的表达量所决定（Broun， 2004）。本研究发现MVA途径中，去氢白菖烯、杜松萜烯的相对含量与FPS基因表达量的变化趋势保持一致。1-石竹烯与HMGR的变化保持一致。MEP合成途径中，α-侧柏酮、崖柏酮、β-侧柏酮的相对含量呈现与DXR、GPS、TPS基因表达量相同的变化。桉树脑与DXS基因的变化一致。这些结果表明，UV-B辐射通过影响各自途径中一些关键基因的表达量，进而在一定程度上影响了神农香菊萜类物质的合成量。在植物萜类物质代谢途径中，改变MVA和MEP两条萜类代谢途径的关键酶的表达量，可以影响下游代谢产物的合成量发生变化（Enfissi et al.， 2005;Morris et al.， 2006）。

本研究结果发现，UV-B辐射对神农香菊萜类物质合成的相关基因表达量可产生一定的影响，而且在较短的辐射时间内对本研究中的酶基因表达量都有明显的促进作用，在研究的4 h内萜类合成相关基因的表达量均高于对照，但对不同种酶基因的促进程度不完全相同。在各自的合成途径中，本研究中的萜类物质大都呈现与该途径中的关键基因相同的变化趋势，在短期UV-B辐射下化合物合成量高于对照，呈现不同程度的促进作用。而位于MVA途径的α-荜澄茄油烯在4 h内先降低后升高不同于HMGR、FPS这两个关键基因的变化趋势，位于MEP合成途径的左旋樟脑相对含量在4 h内持续降低不同于DXR、GPS、TPS和DXS的变化趋势。这一结果说明萜类物质在各自的合成途径中不只是受一些关键基因的调控，而是有着更为复杂的分子机制，有关这一机制有待深入研究。

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