辣木叶乙醇提取物对非酒精性脂肪肝小鼠模型血脂和氧化应激影响的研究

戴丽芬 陆艳华 张曼 田福璐

摘 要： 该研究以低剂量（5 mg·kg-1）、中剂量（30 mg·kg-1）和高剂量（60 mg·kg-1）的辣木叶乙醇提取物（EE-MO）干预高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠动物模型。结果表明：（1）高剂量的EE-MO显著降低NAFLD小鼠的体重和肝湿重;EE-MO剂量依赖性地降低NAFLD小鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量;高剂量的EE-MO除降低上述生化指标外，还显著降低血清中FFA含量。（2）HE和苏丹红Ⅲ染色发现，EE-MO处理后，模型组小鼠的肝脂肪病变和细胞损伤得到显著改善。（3）EE-MO对NAFLD小鼠模型的血脂代谢具有改善作用。（4）高脂饮食诱导小鼠肝脏和血清的ROS和MDA的含量，诱导SOD、POD和CAT活性增加，降低GSH-Px活性。（5）低剂量、中剂量和高剂量的EE-MO依赖性地降低NAFLD小鼠肝脏和血清的ROS和MDA的含量，缓解氧化胁迫。（6）低剂量的EE-MO对SOD、POD、CAT和GSH-Px酶活性无显著影响;中剂量和高剂量的EE-MO处理后，NAFLD小鼠的SOD、POD和CAT酶活性显著下降，GSH-Px活性显著增加;EE-MO可能通过GSH-Px抗氧化酶途径缓解NAFLD小鼠的氧化胁迫。

关键词： 辣木， 氧化应急， 非酒精性脂肪肝， 血脂

中图分类号： Q943.1  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2019）07-0855-08

Abstract： Lower （5 mg·kg-1）， middle （30 mg·kg-1） and high （60 mg·kg-1） doses of ethanol extract of Moringa oleifera （EE-MO） leaves was used to interpose the high fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） mice model. The results were as follows： （1） That oral administration of high dose EE-MO could significantly reduce body weight and wet liver weight of NAFLD mice; EE-MO treatment could decrease the TC， TG， HDL-C and LDL-C contents in serum of NAFLD mice in dose-dependant manner; Apart from decreasing the above parameters， high dose EE-MO treatment significantly reduced FFA content in serum of NAFLD mice. （2） HE and Sudan red Ⅲ staining showed that the fatty lesion and hepatocyte injury of NAFLD mice were improved by EE-MO treatment. （3） It was suggested that EE-MO treatment was capable of improving lipid metabolism of NAFLD mice. （4） High fat diet increased the contents of liver and serum ROS and MDA as well as the activities of SOD， POD and CAT. However， the GSH-Px activity was suppressed by high fat diet. （5） EE-MO treatment could decrease the ROS and MDA contents in liver and serum of NAFLD mice in dose-dependant manner. （6） Oral administration of low dose EE-MO exerted no effect on the activities of SOD， POD， CAT， and GSH-Px of NAFLD mice; However， oral administration of middle and high dose EE-MO significantly reduced the activities of SOD， POD and CAT， but increased the GSH-Px activity; It isuggested that the EE-MO treatment can alleviate the oxidative stress of NAFLD mice by regulating GSH-Px activity.

Key words： Moringa oleifera， oxidative stress， non-alcoholic fatty liver disease， blood fat

辣木（Moringa oleifera）为辣木科辣木属植物，有“奇迹之树”的美称，是一种有独特经济价值的热带植物。辣木原产于印度，从20世纪开始，我国的云南、广东、广西、福建、贵州、台湾等省（区）开展了辣木引种种植和产业化开发研究。辣木浑身是宝，根皮是传统医药原料，嫩叶和嫩果是味道和营养都丰富的蔬菜，种子富含植物油，在国际市场上十分紧俏。据测定，辣木的蛋白质含量为牛奶的2倍、钙为牛奶的4倍、钾为香蕉的2倍、铁为波菜的2倍、维生素C为柑桔的7倍、维生素A为胡萝卜的4倍、维生素E分别是螺旋藻和黄豆粉的70倍和40倍（刘昌芬和李国华，2004）。现代药理学的研究表明，辣木有退热、消炎、排石、利尿、降压、降血脂和抗氧化等功效。在印度和非洲国家辣木常用于治疗糖尿病、高血压、心血管病和肥胖症等（Anwar et al.， 2007; Fahey， 2005; Ghasi et al.， 2000;Song et al.，2017）。杨倩等（2017）发现，不同剂量的辣木水提取物能降低高脂膳食誘导的肥胖大鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C含量。正常的SD大鼠喂食辣木叶粉后，血清中甘油三酯和胆固醇含量显著低于对照组（张幸怡等，2016）。此外，辣木提取物还具有较好的抗氧化作用。体外研究发现，辣木叶乙醇提取物（ethanol extract of Moringa oleifera， EE-MO）对DPPH、ABTS和OH自由基的清除率与正对照BHT相似（周伟等，2017）。辣木茎叶中的水溶性多糖对羟自由基及超氧阴离子均有清除作用，且具有剂量依赖性（梁鹏和甄润英，2013）。在大鼠肾和心肌缺血再灌注模型中，辣木籽提取物能显著降低模型组动物血清的MDA含量，增加血清及肾或心脏中谷胱甘肽过氧化物酶活性，缓解氧化胁迫（曲震理， 2016; 曲震理等， 2017）。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的进展是一个缓慢的过程，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、脂肪性肝纤维化和肝硬化，部分患者甚至可进展为肝细胞癌。近年來，随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，我国的NAFLD发病率明显上升且呈年轻化趋势，现在NAFLD已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。 NAFLD的发病机制尚未完全明确，目前认为主要与胰岛素抵抗（IR）、氧化应激、炎症作用、库普弗细胞与细胞因子、脂代谢紊乱和铁超载等相关（Loomba & Sanyala，2013）。其中，氧化应激和脂代谢紊乱在NAFLD肝细胞损伤过程中具有十分重要的作用。本文主要研究EE-MO对NAFLD小鼠模型血脂和氧化应激的影响，探索EE-MO在改善NAFLD症状方面的有效性，并揭示可能的机理，为辣木的进一步合理开发提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 EE-MO的制备

辣木叶购于云南省昆明市螺蛳湾药材市场。称取2.5 kg干燥的辣木叶，粉碎后，加95%乙醇室温提取3次（每次为6 L，24 h）。合并提取液后，用旋转蒸发仪回收乙醇至无醇味。醇提物用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到干燥粉末状的醇提物。

1.2 动物实验和分组

共有55只SPF级小鼠，随机选取10只为正常对照组 （N-CK），其余45只为模型组。参考钟岚等（2000）的方法复制脂肪肝大鼠模型，用88%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇制成的混合饲料，经机器生产压制成条状，制成高脂饲料。正常组始终喂以普通饲料，模型组喂以高脂肪饲料。模型组从第5周开始从背部后侧注射40%的CCl4豆油溶液，正常组注射纯豆油溶液，注射剂量为2 μL·g-1，每周2次，共3周。造模8周后，随机选择5只模型组小鼠处死，取出肝脏做病理切片，检查模型是否复制成功，确定成功后，从第8周开始，将模型组分为模型对照组（M-CK）、低剂量辣木叶处理组（D-LM）、中剂量辣木叶处理组（Z-LM）和高剂量辣木叶处理组（G-LM）。每天早上9：00，D-LM、Z-LM和G-LM处理组小鼠分别用5、30和60 mg·kg-1的辣木叶提取物灌胃，M-CK处理组给予等体积的生理盐水灌胃。处理期间，N-CK组小鼠继续用普通饲料喂养，所有模型组的小鼠用高脂饲料喂养。持续2周后，将所有小鼠处死，取其血液和肝脏组织，做后续生化指标和病理学检测。

1.3 血液和肝组织生理生化指标检测

TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA含量与ALT和AST活性均采用试剂盒测定。所有操作按照试剂盒说明进行。其中，TC和TG含量所用试剂盒购于上海生物工程技术有限公司。HDL-C、LDL-C和FFA含量所用试剂盒购于大连TAKARA公司。ALT和AST活性测定所用试剂盒购于中国上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

1.4 抗氧化物酶活性测定

用氮蓝四唑法测定SOD酶活性，用愈创木酚法测定POD酶活性，用紫外速率法测定CAT酶活性，用分光光度计比色法测定GSH-Px活性。

1.5 MDA和ROS含量测定

脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸分光光度法测定，ROS含量采用Luminol化学发光法测定（Faulkner & Fridovich，1993）。

1.6 HE染色

将肝脏组织碎片放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液浸泡固定24 h，取出，用自来水冲洗4 h后，依次用50%、70%、80%、90%和100%乙醇浸泡脱水。将脱水后的标本用二甲苯浸泡2次（每次15 min）。用石蜡包埋后，进行切片。切片先依次放入二甲苯I和II进行浸泡脱蜡，然后用95%、85%、70%和50%的梯度酒精溶液中依次浸泡2 min蒸馏水冲洗2 min。标本经苏木素浸染5～15 min和1%伊红水浸染1～5 min，脱水，透明后进行镜检。

1.7 苏丹红Ⅲ染色

参照马羽萍等（2010）的方法。

2 结果与分析

2.1 EE-MO处理对NAFLD小鼠模型体重和肝湿重的影响

如表1所示，高脂饮食8周后，M-CK组小鼠的体重显著高于N-CK组。用低剂量的EE-MO干预2周后，小鼠体重与M-CK组相比无显著性差异。用中、 高剂量的EE-MO干预2周后， 小鼠的体重与M-CK组相比有下降的趋势，虽然Z-LM组小鼠的体重与M-CK组相比仍无显著性差异，但G-LM组小鼠体重显著低于M-CK组。肝湿重与体重的变化趋势类似，M-CK组小鼠的肝湿重显著高于N-CK组。用EE-MO干预2周后，D-LM和Z-LM组与M-CK组小鼠肝湿重无显著性差异，而G-LM组肝湿重显著低于M-CK组。

2.2 EE-MO处理对NAFLD小鼠模型肝TC、TG、HDL-C、LDL-C及FFA含量的影响

如图1：A所示，高脂饮食8周后，M-CK组小鼠血清的TC和TG含量均显著高于N-CK组。EE-MO能够剂量依赖性降低模型组小鼠血清TC和TG的含量。血清LDL-C和HDL-C含量的变化趋势与TC和TG含量变化趋势类似。M-CK组小鼠血清的LDL-C和HDL-C含量均显著高于N-CK组，用EE-MO处理后，NAFLD小鼠模型的LDL-C和HDL-C含量均显著降低 （图1：B）。高脂饮食后，M-CK组血清的FFA含量显著高于N-CK。用不同剂量提取物处理后，D-LM和Z-LM组的血清FFA含量与M-CK组无显著性差异，而G-LM组显著低于M-CK组 （图1：C）。

2.3 EE-MO处理对NAFLD小鼠模型血清ALT和AST活性的影响

如图2所示，NAFLD小鼠模型血清ALT和AST的变化趋势类似，高脂饮食诱导血清ALT和AST活性均显著增加。EE-MO处理后，NAFLD小鼠模型的ALT和AST活性显著下降，且具有剂量依赖性，即血清ALT和AST的活性大小顺序为D-LM>Z-LM>G-LM。

2.4 EE-MO处理对NAFLD小鼠模型血清及肝脏ROS和MDA含量的影响

如图3：A所示，高脂饮食引起血清ROS含量显著增加。用EE-MO处理后，D-LM组处理小鼠血清ROS与M-CK组相比无显著差异。Z-LM和G-LM处理组血清ROS含量显著低于D-LM组，且G-LM组小鼠血清ROS含量低于Z-LM。高脂肪饮食后， M-CK组小鼠肝脏ROS含量显著高于N-CK组。低剂量EE-MO处理后，D-LM组小鼠肝脏ROS含量与M-CK组相比显著降低。中、高剂量EE-MO处理后，Z-LM和G-LM处理组小鼠肝脏ROS含量与D-LM组相比进一步降低，且G-LM组小鼠肝脏ROS含量低于Z-LM （图3：B）。EE-MO能够剂量依赖性地降低NAFLD小鼠模型肝脏ROS含量。血清和肝脏MDA含量与小鼠肝脏ROS含量变化趋势相似，高脂饮食诱导了血液和肝脏组织MDA含量增加，而EE-MO剂量依赖性地降低了NAFLD小鼠模型血液和肝脏组织MDA含量（图3：C，D）。

2.5 EE-MO处理对NAFLD小鼠抗氧化物酶活性的影响

如表2所示，M-CK组血清和肝脏SOD、CAT和POD活性显著高于N-CK组，高脂饮食诱导了上述抗氧化物酶活性增加。D-LM组小鼠血清和肝脏的SOD、CAT和POD活性与M-CK组相比均无显著性差异。Z-LM组的血清和肝脏SOD、CAT和POD活性与M-CK组相比显著下降。类似地，G-LM组血清和肝脏的SOD、CAT和POD活性进一步下降，显著低于Z-LM和M-CK。G-LM组肝脏的SOD、CAT和POD活性恢复到N-CK组水平。M-CK组肝脏和血清的GSH-Px活性显著低于N-CK组，高脂饮食抑制GSH-Px活性。EE-MO处理后，D-LM组肝脏和血清GSH-Px活性与M-CK组无显著差异。Z-LM和G-LM组肝脏和血清GSH-Px活性显著高于M-CK组，且G-LM组GSH-Px活性高于Z-LM组。中、高剂量的EE-MO可以恢复高脂饮食对GSH-Px活性的抑制作用。

2.6 EE-MO处理干预后肝脏的HE染色

如图4所示，N-CK组的小鼠肝索以中央静脉为中心排列规则，肝细胞大小均匀，多数肝细胞只见一个细胞核，部分细胞可见双核。高脂肪饮食8周后，M-CK组小鼠几乎全部肝细胞出现脂肪变性，肝索排列紊乱，肝细胞弥漫性肿大致肝小叶结构不清。肝细胞肿大，有气球样变。用低剂量的EE-MO干预2周后，D-LM组小鼠肝脏仍然有大量肝细胞出现脂肪变性，体积增大，肝索排列紊乱。肝细胞变圆，细胞质内有一定量大小不等的脂肪空泡。Z-LM组小鼠肝细胞一定量的肝细胞脂肪变性，肝细胞肿大变圆，细胞质内有少量大小不等的脂肪空泡。肝索排列稍紊乱。G-LM组小鼠肝索以中央静脉为中心排列规则，有少量肝细胞出现脂肪性变，胞核呈圆形。

2.7 EE-MO处理干预后对肝脏脂肪病变的影响

苏丹Ⅲ染色结果发现，N-CK组小鼠的肝脏染色后并无明显的橘红色，表明肝脏并没有发生明显的脂肪病变。M-CK小鼠的肝脏染色后，大部分组织变成橘红色，肝脏发生了明显的脂肪病变。用低剂量的EE-MO干预2周后，大部分肝脏仍然染成橘红色，但染色面积和着色程度低于M-CK组。用中、高剂量的EE-MO干预后，肝脏的染色面积和着色程度低于D-LM，但Z-LM和G-LM处理组之间无显著差异（图5）。

3 讨论

NAFLD在欧美国家发生率极高，随着亚健康生活方式的流行、肥胖人口增加，NAFLD 在我国发病率呈上升趋势。本研究结果表明，NAFLD患者10 a内进展至肝硬化的概率约为25%，需早期采取干预措施。

“二次打击”学说作为NAFLD的经典发病机制，已被广泛接受。脂类在肝脏细胞的细胞质内聚集（第一次打击）触发了一系列细胞毒素事件。第二次打击为氧化应激反应，是在第一次打击基础上，由活性氧诱导的发生在肝脏实质细胞内的炎症反应，氧化应急是NAFLD病理进展的一个重要原因（Nd，2003）。本研究中，考察了EE-MO对NAFLD小鼠模型氧化胁迫的影响，结果发现高脂诱导了血清和肝脏组织ROS和MDA的积累，表明NAFLD小鼠模型发生了氧化应急事件。EE-MO能够剂量依赖性地降低血清和肝脏组织ROS和MDA的积累，缓解氧化胁迫。对经典抗氧化物酶SOD、CAT和POD进行分析时发现，高脂饮食诱导三种抗氧化物酶活性显著增加，可能是因为高脂饮食诱导了大量ROS的积累，生物体需要通过增加抗氧化物酶的活性，清除过剩的ROS。用低剂量的EE-MO处理后，D-LM处理组血清和肝脏的抗氧化物酶活性与M-CK组无显著性差异。用中、高剂量的EE-MO处理后，Z-LM和G-LM处理组血清和肝脏的经典抗氧化物酶SOD、POD和CAT活性与M-CK组相比有下降的趋势，G-LM处理组血清的SOD、POD和CAT甚至恢复到N-CK水平。虽然高脂肪诱导了NAFLD小鼠血清和肝脏组织抗氧化物酶活性的增加，但中、高剂量EE-MO处理后NAFLD小鼠的SOD、POD和CAT酶活性低于N-CK组，EE-MO并不是通过增加SOD、POD和CAT活性清除ROS，缓解氧化胁迫。此外，还发现高脂饮食抑制GSH-Px活性。EE-MO處理后，血清和肝脏的GSH-Px活性相比模型组显著增加。GSH-Px是除上述经典抗氧化物酶外生物体内存在的另一种重要的过氧化物分解酶。在正常情况下，肝内氧化和抗氧化系统处于动态平衡中，GSH-Px特异地催化GSH对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜及其功能的作用。血清和肝脏 GSH-Px活性在STZ诱导的NAFLD大鼠模型中活性显著下降，用药物干预后其活性恢复到对照水平（Videla et al.，2004;Wang et al.，2013）。本研究发现，EE-MO处理能剂量依赖性地恢复高脂饮食对小鼠肝脏和血清GSH-Px活性的抑制作用，暗示本研究中GSH-Px可能在缓解小鼠NAFLD模型的氧化应激中起着关键作用。此外，EE-MO中含有黄酮、多糖和花青素等二次还原性代谢产物，这些产物也可能通过非酶途径清除NAFLD小鼠体内的ROS，缓解氧化胁迫（陈瑞娇，2006;陈瑞娇等，2007;刘昌芬和李国华，2004）。

除氧化胁迫外，血脂代谢异常是NAFLD病理进展的另一个重要原因。在第一次打击学说中，胰岛素抵抗导致肝脏脂肪变性，进而出现脂质代谢紊乱和肝损伤。本研究还考察了EE-MO处理对NAFLD小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA的影响，结果表明高脂饮食诱导了血清TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA含量的影响，这与前人的研究结果一致（Chao et al.，2014;Li et al.，2013）。低、中和高剂量的EE-MO处理后，FFA含量与M-CK组差别大，但高剂量的EE-MO处理后，FFA含量显著降低。低、中和高剂量EE-MO均可降低NAFLD小鼠模型血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量，减少脂肪在肝脏中的积累，可以通过HE和苏丹红Ⅲ染色进一步证实。上述结果证实EE-MO处理能有效改善NAFLD小鼠模型的血脂代谢。

本研究首次表明EE-MO处理能够有效缓解NAFLD的氧化应急和血脂代谢紊乱，中、高剂量的EE-MO缓解效果优于低剂量处理。然而，本研究中用EE-MO对NAFLD小鼠模型仅进行了2周处理，虽然在整个处理期间，没有小鼠发生死亡，但是在高剂量处理下，是否EE-MO会对小鼠产生毒性还值得进一步研究。

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