纤维素纳米晶体提升柚皮素抗氧化活性的研究

刘艳新 李湘洲 周军 刘庆坚 韩俊源 王玥 王玉珑

摘要： 柚皮素是一种黄酮类化合物，具有广泛的药理活性，具有抗炎、抗氧化、抗癌、降血脂等药理作用。然而，柚皮素在水中溶解性能差，生物利用度低，限制了其在临床中的应用。本研究以纤维素纳米晶体（Cellulose nanocrystals，CNCs）为载体，以柚皮素为疏水药物模型，利用反溶剂重结晶法成功制备了CNCs/柚皮素纳米复合物，并表征了所得纳米复合物的性能，分析了纳米复合物中柚皮素的溶出性能和抗氧化活性。结果表明，形成CNCs/柚皮素纳米复合物后，柚皮素得到充分的纳米化和稳定分散，从结晶态转变为无定型态。负载CNCs的柚皮素在水中的溶出性能得到显著提升，120 min时累积溶出度达到93.4%;经CNCs负载后，当柚皮素浓度为50 μg/mL时，羟基自由基清除率达44.3%，柚皮素的体外抗氧化活性显著提高。

關键词：纤维素纳米晶体;柚皮素;纳米化;溶解性能;抗氧化活性

中图分类号：TS721;TB324  文献标识码：A

DOI：10.11980/j.issn.0254-508X.2019.09.002

Abstract： As a typical flavonoid， naringenin exhibits attractive pharmacological activities， including anti-inflammatory， anti-oxidation， anti-cancer properties， and lowering lipids. However， due to its poor water solubility and low bioavailability in aqueous solutions， the pharmaceutical application of naringenin is very limited. In this study， cellulose nanocrystals （CNCs） were used as carriers for naringenin， and the CNCs/naringenin nanocomposite was prepared based on anti-solvent recrystallization method. The CNCs/naringenin nanocomposite was characterized and its dissolution and anti-oxidation activity in aqueous systems were investigated. The results showed that naringenin was effectively nanolized and well dispersed， as well as transformed from crystalline state to amorphous state in aqueous system based on the formation of CNCs/naringenin nanocomposite. The cumulative dissolution of naringenin in CNCs/naringenin nanocomposite obviously increased to 93.4% at 120 min. Furthermore， the in vitro anti-oxidation activity of naringenin was clearly enhanced based on the formation of CNCs/naringenin nanocomposite. The above results supported the conclusion that the use of CNCs as nanocarriers for naringenin was a promising technique to improve the bioavailability of naringenin in aqueous systems.

Key words： cellulose nanocrystals; naringenin; nanolization; dissolution; anti-oxidation

柚皮素（4，5，7-三羟黄烷酮）是一种黄酮类化合物，主要存在于芸香科植物中，如柚子、西红柿、葡萄及柑橘类水果等[1-3]，其化学结构式见图1。研究表明，柚皮素具有广泛的药理活性，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、降血脂等药理作用[4-7]。然而，柚皮素的水溶性极低，口服制剂溶出速率缓慢，口服生物利用度仅为5.81%，极大地限制了柚皮素在临床中的应用[8]。目前，研究工作者尝试采用多种方法提高柚皮素的生物利用度，Shulman等人[9]制备了羟丙基-β-环糊精/柚皮素复合物，显著提升了柚皮素在水中的溶解速率及在小鼠体内的生物利用度;Khan等人[10]采用固态分散技术，将柚皮素进行纳米化处理，提高了柚皮素的体外释放效果及体内药理活性。Shpigelman等人[11]和Wang等人[12]分别以β-乳球蛋白和脂质体作为纳米载体，对柚皮素进行负载，从而提高了柚皮素的溶出性能及体外和体内的药理活性。

近年来，以天然可降解生物质材料为原料制备药物载体引起了研究者的高度关注。纤维素纳米晶体（Cellulose Nanocrystals，CNCs）是对植物纤维原料进行物理、化学、物理/化学、酶水解等处理而获得的一种新型纳米材料[13-14]，其长度一般为100～500 nm，宽度5～20 nm[15-16]。由于其具有可再生、可生物降解、无毒、化学修饰性高等优势，CNCs在药物载体制备中显示出巨大潜力[17]。Jackson等人[18]对CNCs进行疏水改性后用于负载水不溶性抗癌药物，如紫杉醇、多西他赛、依托泊苷等，取得了良好的药物缓释和控释效果。Mohanta等人[19]制备了CNCs基微胶囊和膜材料并用于负载姜黄素，提升了姜黄素的生物利用度和分散性。You等人[20]将阳离子CNCs和纤维素通过β-甘油磷酸酯交联反应后制备了可注射水凝胶，负载阿霉素后的水凝胶在小鼠体内展现出良好的药物缓释作用及抗肝癌效果。

本研究以CNCs为载体，以柚皮素为疏水性药物模型，通过反溶剂重结晶法将柚皮素负载于CNCs上，形成CNCs/柚皮素纳米复合物。利用红外光谱仪、透射电子显微镜、X射线衍射仪等对CNCs/柚皮素纳米复合物的性能进行表征;并对负载前后柚皮素的溶出性能和抗氧化活性（羟基自由基清除法）进行分析，以期为CNCs在疏水性药物负载中的应用提供技术支持。

1 实 验

1.1 实验原料

纤维素纳米晶体（CNCs），采用硫酸水解油茶果壳纤维制得，长度80～350 nm，宽度5～25 nm，Zeta 电位-38 mV;柚皮素（纯度≥98%），上海源叶生物科技有限公司;磷酸盐缓冲液（PBS）、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、无水乙醇等，国药集团（北京）化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

数显恒温水浴锅（HH-2，上海力辰仪器科技有限公司）;超声波细胞破碎仪（HUP-100，天津恒康机械设备有限公司）;真空冷冻干燥机（FD-1A-50，北京博医康实验仪器有限公司）;紫外可见分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限公司）;傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR，Nicolet iS5，美国Thermo fisher仪器公司）;透射电子显微镜（TEM，JEM-2010，日本电子株式会社）;X射线衍射仪（XRD，D8 Advance，德国布鲁克公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 CNCs/柚皮素纳米复合物的制备

将100 mg冷冻干燥的油茶果壳CNCs置于烧杯中，加入100 mL去离子水，经超声波细胞破碎仪分散10 min后，得到质量分数约为0.1%的油茶果壳CNCs分散液，备用。一定量的柚皮素原料溶于無水乙醇中，配制成质量浓度为1 mg/mL的柚皮素无水乙醇溶液。在磁力搅拌及冰水浴条件下，将2 mL柚皮素无水乙醇溶液（1 mg/mL）逐滴加入20 mL 0.1%的油茶果壳CNCs分散液中;滴加完毕后，继续搅拌15 min，获得CNCs/柚皮素纳米复合物悬浮液，冷冻干燥，备用。

对照样的制备：取2 mL柚皮素无水乙醇溶液   （1 mg/mL）逐滴加入20 mL去离子水中，滴加完毕后继续搅拌15 min，制得无CNCs载体的柚皮素颗粒，标记为反溶剂重结晶柚皮素颗粒。

1.3.2 CNCs/柚皮素纳米复合物的性能表征

FT-IR分析：冷冻干燥后的试样使用Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱仪进行分析，扫描范围400～4000 cm-1，分辨率为 4 cm-1。

TEM分析：待测试样用去离子水稀释至质量浓度为0.01 mg/mL，滴于专用铜网试样台上，在室温下风干24 h。采用透射电子显微镜对风干后的试样进行观测（加速电压200 kV）。

XRD分析：冷冻干燥后的样品采用X射线衍射仪进行分析;测试条件：Cu，Kα辐射（λ=1.54）产生X射线，加速电压40 kV，2θ扫描范围3°～50°，扫描速度0.02 °/s。

1.3.3 累积溶出度测定

柚皮素的累积溶出度测定参考Kocbek等报道的方法[21]，具体测定步骤在该文献方法的基础上略微改进，累积溶出度按照公式（1）计算[22]。具体步骤如下：将含柚皮素2 mg的试样置于100 mL PBS缓冲溶液中（pH值=7.4），控制水浴温度为（37±0.5）℃，摇床转速设定为100 r/min。分别于5、10、20、40、60、80、100、120 min 取样5 mL，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，所得滤液采用紫外可见分光光度计在290 nm波长下测定柚皮素的吸光度。每次取完5 mL试样后，立刻补充同体积等温新鲜PBS介质，以维持总释放体积不变（每次取样和补充新鲜介质操作在30 s内完成）。根据事先标定的柚皮素标准溶出曲线及吸光度结果，计算溶出介质中溶出柚皮素的质量，并绘制柚皮素累积溶出曲线。

1.3.4 体外抗氧化活性测定

试样的体外抗氧化活性分析通过测定其羟基自由基（·OH）清除率的方法进行评价，具体实验步骤参考Smirnoff等报道的水杨酸羟基化法[23]。本方法采用Fenton氧化反应产生·OH，然后采用水杨酸对·OH进行捕捉。氧化反应体系由150 mmol/L PBS缓冲溶液（pH值=7.4），0.15 mmol/L Fe3+-EDTA，2 mmol/L水杨酸，0.26 mmol/L抗坏血酸，0.6 mmol/L H2O2和待测样品组成。氧化反应体系在（37±0.5）℃下培育100 min，采用紫外可见分光光度计在530 nm处测定反应体系吸光度，·OH清除率根据公式（2）计算。

式中，为空白试样的吸光度，表示产生的总羟基自由基数量;为加入含柚皮素试样后体系的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 FT-IR分析

柚皮素、CNCs和CNCs/柚皮素纳米复合物的FT-IR分析结果如图2所示。从图2可以看出，柚皮素在3021、1630、1590和1510 cm-1处出现的特征吸收峰，分别来源于酚羟基振动、羰基振动和苯环振动。Semalty等人[24]在研究中也报道了相似的柚皮素FT-IR特征吸收峰。CNCs在3320、2890、1050和1030 cm-1处出现的特征吸收峰，分别来源于羟基振动、碳氢键振动、仲醇羟基和伯醇羟基振动，与其他来源的CNCs具有高度的吻合性[25-27]。当形成CNCs/柚皮素纳米复合物后，CNCs中3320 cm-1处的羟基吸收峰及1050和1030 cm-1处的仲醇羟基和伯醇羟基的吸收峰强度显著增加，分析认为这是由于柚皮素分子中的酚羟基和CNCs中的羟基相互作用形成新氢键的原因。同时，CNCs/柚皮素纳米复合物中也能够观察到柚皮素的部分特征峰，表明柚皮素成功负载于CNCs表面。

2.2 TEM分析

柚皮素、CNCs、反溶剂重结晶柚皮素颗粒及CNCs/柚皮素纳米复合物的表面形貌如图3所示。从图3可以看出，柚皮素呈现为晶体形态，尺寸大，宽度接近2 μm（见图3（a））;实验分散过程中发现柚皮素很难润湿，大部分漂浮于去离子水表面，这是由柚皮素的强疏水性引起的。经过反溶剂重结晶处理后，柚皮素变为结构规则的针状颗粒，长度约1～1.5 μm，宽度约100～250 nm（见图3（c））;形成反溶剂重结晶颗粒后，柚皮素在水中的分散性和稳定性得到改善，但室温放置24 h后，体系稳定性下降，出现柚皮素颗粒絮团。而形成CNCs/柚皮素纳米复合物后，针状柚皮素颗粒消失，转变为无定型态的柚皮素颗粒，均匀分散在CNCs体系中（见图3（d）），实验中发现CNCs/柚皮素纳米复合物悬浮液的分散性和稳定性良好，室温放置72 h无明显团聚现象。

2.3 XRD分析

柚皮素、CNCs、反溶剂重结晶柚皮素颗粒和CNCs/柚皮素纳米复合物的XRD分析如图4所示。从图4可以看出，柚皮素在2θ=10.76°、15.92°、17.24°、18.15°、19.90°、20.52°、22.20°、23.80°、24.43°、25.34°和27.71°处存在强烈的衍射峰，表明柚皮素处于高度结晶态。反溶剂重结晶处理形成的柚皮素颗粒在2θ=10.76°、15.92°、18.15°、20.52°、22.20°、25.34°存在XRD衍射峰，但衍射峰的强度相比柚皮素显著降低，表明反溶剂重结晶处理降低了柚皮素的结晶度。而形成CNCs/柚皮素纳米复合物后，柚皮素的XRD衍射峰全部消失，表明柚皮素完全转变为无定型态，分析认为柚皮素负载于CNCs上后柚皮素被充分的纳米化是其转变为无定型態的主要原因。据研究报道，疏水药物的纳米化有助于提高其比表面积和在水中的溶出性能，从而提高其生物利用度[28]。

2.4 累积溶出度分析

柚皮素、反溶剂重结晶柚皮素颗粒和CNCs/柚皮素纳米复合物中柚皮素的累积溶出度如图5所示。  从图5可以看出，柚皮素在水中的累积溶出度非常低，120 min时累积溶出度仅为1.7%。经过反溶剂重结晶处理形成柚皮素颗粒后，柚皮素的累积溶出度增加，120 min时累积溶出度达到34.7%，这是因为反溶剂重结晶过程中柚皮素被颗粒化，比表面积增加，因而提高了其溶出性能。

相比之下，形成CNCs/柚皮素纳米复合物后，柚皮素的累积溶出度得到显著提升，在10 min时累积溶出度即可达到52.7%，120 min时达到93.4%。这是因为柚皮素负载于CNCs上后，柚皮素被充分纳米化和稳定分散。研究表明，疏水性药物在水中的溶出度和其生物利用度具有良好的相关性，相关文献报道了通过提高姜黄素、槲皮素、金雀异黄酮等疏水性药物在水中的溶出性能而显著提高药物生物利用度方面的研究[22，29-30]。

2.5 体外抗氧化性能

羟基自由基（·OH）是活性氧的一种。研究表明，·OH在人体内含量大时危害最严重，许多疾病的产生均与·OH有较高的相关性，如癌症、糖尿病、动脉硬化及其他炎症等。目前，检测·OH清除率是评价药物抗氧化性能的主要方法之一。本实验中对柚皮素、反溶剂重结晶柚皮素颗粒及CNCs/柚皮素纳米复合物的·OH清除率进行分析，结果如图6所示。

从图6可以看出，柚皮素的·OH清除率很低，柚皮素浓度为50 μg/mL时，·OH清除率仅为4.1%，表明柚皮素的药理活性很难得到发挥。经过反溶剂重结晶形成柚皮素颗粒后，·OH清除率增加，浓度为50 μg/mL时，·OH清除率为12.6%。而形成CNCs/柚皮素纳米复合物后，柚皮素的·OH清除率显著提升;在浓度为10 μg/mL时，·OH清除率为25.6%，浓度为50 μg/mL时，·OH清除率达到44.3%。以上结果表明，柚皮素负载在CNCs上后，体外抗氧化性能得到显著提升。

3 结 论

本研究以纤维素纳米晶体（CNCs）为载体，以柚皮素为水不溶性药物模型，通过反溶剂重结晶法将柚皮素负载于CNCs上，形成CNCs/柚皮素纳米复合物。并对所制得的CNCs/柚皮素纳米复合物进行了性能表征，评估了负载前后柚皮素的溶出性能及体外抗氧化活性。

3.1 透射电子显微镜（TEM）和X射线衍射（XRD）的分析结果表明，形成CNCs/柚皮素纳米复合物后，柚皮素被充分纳米化和稳定分散，柚皮素从结晶态转变为无定型态。

3.2 CNCs/柚皮素纳米复合物的形成，使柚皮素在水中的溶出性能显著提升，120 min时累积溶出度达到93.4%;而同样条件下，柚皮素和反溶剂重结晶的柚皮素颗粒的累积溶出度仅为1.7%和34.7%。

3.3 CNCs/柚皮素纳米复合物的形成，柚皮素的体外抗氧化性能显著提高，当CNCs/柚皮素纳米复合物浓度为50 μg/mL时，·OH清除率达到44.3%;而同样浓度下，柚皮素和反溶剂重结晶柚皮素颗粒的·OH清除率仅为4.1%和12.6%。

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（责任编辑：黄 举）