HPLC法测定注射用核黄素磷酸钠中核黄素的含量

李 滋，刘 帅，王 卫

(天津市药品检验研究院，天津300070)

核黄素磷酸钠是核黄素(维生素B2)的磷酸盐形式。核黄素是人体重要的微量元素之一，在能量代谢中起关键作用，临床上主要用于防治口角炎、舌炎、阴囊炎、结膜炎、脂溢皮炎等核黄素缺乏症。近年来研究发现其在感染、烧伤、发热、肿瘤放化疗等方面亦有很好的辅助治疗作用[1-3]。注射用核黄素磷酸钠收载于《国家食品药品监督管理总局国家药品标准》中，其含量(以核黄素计)采用紫外分光光度法测定。本试验采用高效液相色谱法测定注射用核黄素磷酸钠中核黄素的含量，专属性强，灵敏度高，具有较好的重复性和准确性。

1 仪器与试药

华谱S6000高效液相色谱仪，Agilent1260高效液相色谱仪，XSE 205分析天平(METTLER TOLEDO)，phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Acchrom Tnature C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；核黄素磷酸钠混合物对照品(中国食品药品检定研究院，批号100283-201202)，维生素B2(核黄素)对照品(中国食品药品检定研究院，批号100369-201504)；注射用核黄素磷酸钠样品，规格为5 mg(按核黄素计)，两个厂家的3批样品的批号分别为A厂11716039、11716040，B厂2161202；甲醇为色谱纯(Merck公司)，磷酸二氢钾为分析纯(aladdin公司)，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.054 mol/L磷酸二氢钾溶液(15∶85)，流速：0.8 ml/min，柱温：40 ℃，检测波长：267 nm，进样20 μl。含量计算公式如下：

式中∑At为供试品溶液色谱图中核黄素磷酸钠峰、3’-核黄素磷酸钠峰、4’-核黄素磷酸钠峰及游离核黄素峰的峰面积之和，As为对照品溶液色谱图中核黄素峰面积,Ws为核黄素对照品称样量。

2.2溶液制备

2.2.1对照品贮备液的制备 避光操作。取核黄素对照品约15 mg，置50 ml量瓶中，加盐酸1 ml使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀。

2.2.2对照品溶液的制备 避光操作。取核黄素对照品约10 mg，置50 ml量瓶中，加盐酸1 ml使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀。

2.2.3供试品溶液的制备 避光操作。取本品5支，将各容器内容物分别加流动相溶解后全量转移至同一量瓶中，混匀，精密量取适量，用流动相定量稀释制成每1 ml中约含核黄素0.2 mg的溶液，摇匀。

2.2.4空白辅料溶液 按处方比例，制备不含核黄素磷酸钠的空白辅料溶液。

2.3系统适用性试验 取核黄素磷酸钠混合物对照品约10 mg，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。核黄素磷酸钠峰的保留时间约为40 min，核黄素磷酸钠峰与4’-核黄素磷酸钠峰的分离度为3.7(应大于2.0)。结果见图1。

2.4专属性考查 按照“2.1”项下的色谱条件，精密量取对照品溶液、供试品溶液和空白辅料溶液各20 μl，注入液相色谱仪，空白溶液对测定无干扰，见图2。

1.3’,4’-核黄素二磷酸酯2. 3’,5’-核黄素二磷酸酯3. 4’,5’-核黄素二磷酸酯 4. 3’-核黄素磷酸钠5. 4’-核黄素磷酸钠 6. 核黄素磷酸钠 7. 核黄素

1. 3’-核黄素磷酸钠2. 4’-核黄素磷酸钠 3. 核黄素磷酸钠 4. 核黄素

2.5线性关系考查 精密量取对照品贮备液适量，加流动相使溶解并稀释制成浓度分别为0.09、0.12、0.18、0.24和0.3 mg/ml的系列溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以浓度为横坐标(C)，以峰面积为纵坐标(A)，进行线性回归。结果表明核黄素在0.09～0.3 mg/ml浓度范围内与峰面积呈良好线性关系，线性方程为A=118 938C+33.5(r=0.999 9,n=5)。

2.6重现性试验 取同一批样品依“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进样测定。结果核黄素的平均含量为99.8%，RSD为1.5%，表明该方法重现性良好。

2.7稳定性试验 取对照品溶液和供试品溶液在室温条件下避光放置24 h，依“2.1”项下的色谱条件进样，测定0和24 h时的峰面积，结果RSD均为0.3%，表明对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定。

2.8回收率试验 取核黄素对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 ml中含2 mg核黄素的浓对照品溶液。取供试品20支，将各容器内容物分别加流动相溶解后全量转移至同一100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10 ml置100 ml量瓶中，分别精密加入4、5和6 ml的浓对照品溶液(各3份)，用流动相稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件进样测定含量，计算回收率。结果平均回收率为99.8%，RSD为0.7%。见表1。

表1 回收率试验结果(n=9)

2.9耐用性试验 采用不同的厂家的仪器和色谱柱进行耐用性考查。条件1：华谱S6000液相色谱仪，phenomenex Luna C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；条件2： Agilent 1260液相色谱仪，Acchrom Tnature C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。试验结果见表2，结果基本一致，表明该方法的耐用性良好。

表2 耐用性试验结果

2.10样品测定 照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进行测定，计算供试品中核黄素的含量，并与国家药品标准的紫外方法进行比较，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

3.1流动相的考查 文献资料中采用了不同种类的流动相[4-7]，为了达到更好的分离效果，最终采用甲醇-0.054 mol/L磷酸二氢钾溶液(15∶85)为流动相，各峰能够达到基线分离，满足含量测定的要求。

3.2波长的选择 根据紫外扫描图谱，核黄素在267 nm波长处有最大吸收，参考《中国药典》2015年版二部核黄素磷酸钠的含量测定[8]，选择267 nm为检测波长。

采用HPLC法测定注射用核黄素磷酸钠中的核黄素含量，操作简便，专属性强，重现性好，具有较高的灵敏度及较好的准确性和精密度，适用于注射用核黄素磷酸钠的质量控制。