HPLC法测定氨酚氯雷伪麻缓释片3种有效成分的含量

高 娟，王 卫，唐素芳

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

氨酚氯雷伪麻缓释片[1]为复方抗感冒药，含对乙酰氨基酚、硫酸伪麻黄碱和氯雷他定等成分。经查询，国家食品药品监督管理局的数据库中共有4家生产企业生产4个批准文号，分别在国家食品药品监督管理局YBH33042005、YBH11212008、YBH33282005和YBH03682008 4个国家标准中收载，国外药典均无收载。本文按国家药品标准提高任务书的要求采用HPLC法对氨酚氯雷伪麻缓释片中3种活性成分的含量测定进行了方法学研究和验证，统一并完善了现有标准，完成了氨酚氯雷伪麻缓释片的国家药品标准提高工作，进一步保证产品安全、有效和质量可控。

1 仪器与试药

Aglient 1260 高效液相色谱仪。对乙酰氨基酚对照品(中国食品药品检定研究院化学药品检定所，批号100018-200408，纯度：100.0%)；硫酸伪麻黄碱对照品(深圳沃兰德药业有限公司，批号Y85130102，标化纯度：99.5%)；氯雷他定对照品(常州亚邦制药有限公司，批号Y64121001，标化纯度：99.2%)；氨酚氯雷伪麻缓释片1#～3#(A药厂提供，批号1408475-1、1408475-3、1408475-4)；氨酚氯雷伪麻缓释片4#～6#(B药厂提供，批号1305011、1412008、1507002)；甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，磷酸二氢钾(分析纯，天津市赢达稀贵化学试剂厂)，十二烷基硫酸钠(LAB级，德国Merck公司)，醋酸(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1对乙酰氨基酚

2.1.1色谱条件与系统适用性[2]采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(20∶80)；流速为1.0 ml/min；检测波长为243 nm；柱温为40 ℃；进样量为20 μl。按上述色谱条件进行测定，理论板数按对乙酰氨基酚峰计不低于3 000。

2.1.2溶液的制备

2.1.2.1对照品溶液 取对乙酰氨基酚对照品，精密称定，加20%甲醇溶液溶解并定量稀释制成每1 ml中约含对乙酰氨基酚0.10 mg的溶液。

2.1.2.2供试品溶液 取本品10片，研细，用20%甲醇溶液分次转移至500 ml量瓶中，振摇2 h使溶解，放冷，加20%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液适量，13 000 r/min离心5 min，取上清液滤过，精密量取续滤液1 ml，置100 ml量瓶中，加20%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2.3阴性对照溶液 分别称取不同厂家空白辅料和缺对乙酰氨基酚的阴性对照各适量，同法制备、测定辅料溶液和阴性对照溶液，记录色谱图，结果显示，空白辅料及其他两种活性成分对对乙酰氨基酚的含量测定均无干扰，见图1。

2.1.3线性关系试验 精密称取对乙酰氨基酚对照品适量，溶解并逐步稀释制成每1 ml中含对乙酰氨基酚2、20、50、100、200和300 μg的系列溶液，分别精密取上述溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对乙酰氨基酚浓度C对峰面积A作标准曲线，在2～300 μg/ml的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为A=116.05C+0.14(r=0.999 9，n=6)。

2.1.4精密度试验 精密吸取对乙酰氨基酚对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样6次，峰面积的RSD分别为0.04%和0.20%，精密度符合要求。

1.对乙酰氨基酚

2.1.5稳定性试验 取对乙酰氨基酚对照品和供试品溶液，分别于制备后0、6、12和24 h测定，记录峰面积，峰面积的RSD分别为0.16%和0.10%，两种溶液在24 h内均稳定。

2.1.6重复性试验 取4#供试品10片，共6份，依“2.1.2.2”项下法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，对乙酰氨基酚的含量测定结果平均值为99.82%，RSD为0.62%，重复性良好。

2.1.7回收率试验 精密称取1片对应量的空白辅料0.25 g、硫酸伪麻黄碱对照品60 mg及氯雷他定对照品浓溶液(0.1 mg/ml)25 ml，置同一50 ml量瓶中，共制备9份，分别精密加入对乙酰氨基酚对照品400、500和600 mg各3份，加20%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取溶液适量，13 000 r/min离心5 min，取上清液滤过，精密量取续滤液1 ml，置100 ml量瓶中，加20%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得，依“2.1.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为99.8%，RSD为0.70%。见表1。

表1 对乙酰氨基酚回收率试验结果(n=9)

2.1.8供试品含量测定 取1#～6#样品，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，含量测定结果分别为：97.3%、98.9%、100.1%、99.8%、97.6%和96.4%，均在拟规定的限度范围(90.0%～110.0%)内。

2.1.9耐用性试验 方法1：Agilent1260型高效液相色谱仪，Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；方法2：岛津LC-2010C型高效液相色谱仪，Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。使用不同型号的液相色谱仪和色谱柱测定对乙酰氨基酚的含量，结果一致。

2.2硫酸伪麻黄碱和氯雷他定

2.2.1色谱条件与系统适用性 采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；以甲醇-1%十二烷基硫酸钠-醋酸(75∶25∶1)为流动相；流速为1.0 ml/min；检测波长为257 nm；柱温：40 ℃；进样量20 μl。理论板数按氯雷他定峰计算不低于3 000，硫酸伪麻黄碱峰与氯雷他定峰的分离度应符合要求。

2.2.2溶液的制备

2.2.2.1对照品溶液的制备 取硫酸伪麻黄碱对照品与氯雷他定对照品，精密称定，用75%甲醇溶液溶解并定量稀释制成每1 ml中约含硫酸伪麻黄碱1.2 mg与氯雷他定50 μg的溶液。

2.2.2.2对照品溶液的制备 取本品10片，研细，用75%甲醇溶液适量分次转移至500 ml量瓶中，振摇2 h使溶解，放冷，加75%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液适量，13 000 r/min离心5 min，用微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2.2.3阴性对照溶液 分别称取不同厂家空白辅料、缺硫酸伪麻黄碱和氯雷他定的阴性对照1、缺硫酸伪麻黄碱的阴性对照2、缺氯雷他定的阴性对照3各适量。同法制备和测定各溶液，记录色谱图，结果显示，空白辅料及对乙酰氨基酚对硫酸伪麻黄碱和氯雷他定的含量测定均无干扰，且硫酸伪麻黄碱和氯雷他定互无干扰，见图2。

2.2.3线性关系试验

2.2.3.1硫酸伪麻黄碱 取硫酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加75%甲醇溶液并逐步稀释制成每1 ml中含硫酸伪麻黄碱0.12、0.24、0.6、1.2、2.4 和3.6 mg的系列溶液，分别精密取上述溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以硫酸伪麻黄碱浓度C对峰面积A作标准曲线，在0.12～3.6 mg/ml的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为A=389.34C+0.52(r=0.999 99，n=6)。

1.对乙酰氨基酚 2.硫酸伪麻黄碱 3.氯雷他定

2.2.3.2氯雷他定 取氯雷他定对照品适量，精密称定，加75%甲醇溶液并逐步稀释制成每1 ml中含氯雷他定2、20、50、100、200和300 μg的系列溶液，分别精密取上述溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对乙酰氨基酚浓度C对峰面积A作标准曲线，在2～300 μg/ml的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为A=16.80C+0.77(r=0.999 99，n=6)。

2.2.4精密度试验 精密吸取硫酸伪麻黄碱、氯雷他定对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样6次，对照溶品液两峰峰面积的RSD分别为0.11%和0.13%，供试品溶液两峰峰面积的RSD分别为0.09%和0.12%，符合要求。

2.2.5稳定性试验 取硫酸伪麻黄碱和氯雷他定对照品溶液及供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12和24 h后按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，对照品溶液两峰峰面积的RSD分别为0.56%和0.49%，供试品溶液两峰峰面积的RSD分别为0.15%和0.57%，4种溶液在24 h内均稳定。

2.2.6重复性试验 取6#供试品10片，共6份，精密称定，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果硫酸伪麻黄碱含量平均值为104.83%，RSD为0.59%；氯雷他定含量平均值为102.71%，RSD为0.35%，重复性良好。

2.2.7回收率试验

2.2.7.1硫酸伪麻黄碱 精密称取1/5片对应量的空白辅料50 mg、对乙酰氨基酚对照品0.1 g及氯雷他定对照品浓溶液(0.1 mg/ml)5 ml，置同一10 ml量瓶中，共9份，分别精密加入硫酸伪麻黄碱对照品9.6、12和14.4 mg，各3份，加75%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取溶液适量，13 000 r/min离心5 min，用微孔滤膜滤过，取续滤液,依“2.2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为100.2%，RSD为0.60%，见表2。

表2 硫酸伪麻黄碱回收率试验结果(n=9)

2.2.7.2氯雷他定 精密称取1/5片对应量的空白辅料50 mg、对乙酰氨基酚对照品0.1 g及硫酸伪麻黄碱对照品12 mg，置同一10 ml量瓶中，共9份，分别精密加入氯雷他定对照品浓溶液(0.1 mg/ml)4、5和6 ml，各3份，加75%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，取溶液适量，13 000 r/min离心5 min，用微孔滤膜滤过，取续滤液，依“2.2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为100.0%，RSD为0.55%，见表3。

2.2.8供试品含量测定 取两个生产单位6批样品按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按和“2.2.1”项下色谱条件进样测定。硫酸伪麻黄碱的含量测定结果分别为：108.0%、107.5%、107.1%、106.1%、105.6%和104.8%；氯雷他定的含量测定结果分别为：96.2%、94.3%、94.7%、 97.2%、 102.9%和102.7%。均在拟规定的限度范围(90.0%～110.0%)内。

2.2.9耐用性试验 方法1：Agilent1260型高效液相色谱仪，Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；方法2：岛津LC-2010C型高效液相色谱仪，Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。使用不同型号的液相色谱仪和色谱柱测定硫酸伪麻黄碱和氯雷他定的含量，结果一致。

3 讨论

3.1本品含对乙酰氨基酚、硫酸伪麻黄碱和氯雷他定3种活性成分，3种成分含量及极性差异较大，导致提取方法和含量测定的色谱条件均不同。本文建立的对乙酰氨基酚含量测定方法可用于对氨基酚的检查及对乙酰氨基酚释放度的检查；硫酸伪麻黄碱、氯雷他定含量测定方法可以用于硫酸伪麻黄碱释放度、氯雷他定溶出度及两种活性成分含量均匀度的检查。

3.2片剂进行含量测定时，一般取研细并混匀后的片粉适量制备供试品溶液，而氨酚氯雷伪麻缓释片包衣层中含有活性成分氯雷他定，而包衣具一定延展性，研磨时不易被研细，且易附着于研钵壁，很难与片粉混匀，故采用研细后使用溶剂转移整片供试品方法制备。