外源磷酸钠对枣果实活性氧和苯丙烷代谢关键酶活性及酚类物质积累的影响

温晓丽

（鞍山师范学院化学与生命科学学院，辽宁鞍山 114000）

枣是一种典型的药食兼用水果，具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳等保健作用[1]。枣亦富含多种营养物质，相较于一般水果，糖含量较高，还包含维生素C、脂肪、膳食纤维、氨基酸、蛋白质、环磷酸鸟苷、环磷酸腺苷、酚、类黄酮以及矿物质等[2]。三星枣是我国御寒能力很强的枣品种之一，肉质嫩脆、产量稳定、成熟快、营养物质均衡，被称为“北方玛瑙”[3]。枣果实采收正值高温季节，采后呼吸速率较大，易导致果实失水萎蔫、软化、酒软等而失去食用价值[4]。因此，延长鲜枣的保鲜期和提高其品质已成为枣产业发展及其产业化的关键问题[5-6]。

磷酸钠为白色或无色晶体，可通过增加pH 和增强离子强度来提高食品的保水能力，从而作为一种品质改良剂在食品工业中广泛应用[7]。磷酸钠在果蔬采后防腐保鲜中也有一些报道。王修俊等[8]研究发现，复合磷酸盐处理可以有效防止鲜切青苹果的酶促褐变。已有研究证明，采后磷酸钠处理可诱导苹果果实对黑斑病的抗性，并且促进了苯丙烷和活性氧代谢关键酶活性和次生代谢产物的积累[9-10]。此外，采后磷酸钠处理可降低枣果实的还原糖含量，抑制枣果实蔗糖代谢中的酸性转化酶、中性转化酶、蔗糖合酶裂解、蔗糖合酶合成和蔗糖磷酸合酶活性从而抑制果实呼吸速率，达到保鲜效果[11]。枣果实的研究还证明，采后精氨酸、1-MCP 等处理可以增强果实抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）活性，激活苯丙烷代谢来降低枣皮细胞膜通透性并增加果实的抗病性[12-13]。由此说明，活性氧代谢和苯丙烷代谢在果实抗病中具有重要作用。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）和4-香豆酰CoA 连接酶（4-coumarate/coenzyme A ligase，4CL）是苯丙烷代谢途径的关键酶，其活性高低与酚类、黄酮类和木质素等产物的积累密切相关[14]。此外，采后诱抗剂处理还可以诱导果实胞内H2O2积累，从而作为信号分子激活苯丙烷代谢途径，提高了PAL 和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性，促进木质素、酚类物质等的积累，以抵抗病原菌的侵染并提高贮藏性能[14-16]。综上所述，活性氧代谢、苯丙烷代谢途径与果蔬抗性密切相关。然而，尚未见采后磷酸钠处理对枣果实活性氧和苯丙烷代谢影响的报道。

本研究以三星枣为对象，分析磷酸钠处理后果实H2O2含量及其清除相关酶GR 和APX 活性，苯丙烷代谢关键酶PAL、4CL 和POD 活性及酚类物质含量的变化，为揭示磷酸钠提高枣果实保鲜效果的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三星枣 采自辽宁省朝阳市，选取无损伤、质地优良、大小均一的果实，成熟度为半红果，纸箱包装后当天运回实验室进行处理；磷酸钠 北京索莱宝生物科技有限公司；盐酸（36%～38%）、硫酸（95%～98%）、四氯化钛 锦州古城化学试剂厂；氢氧化钠福晨（天津）化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠天津博迪化工股份有限公司；交联聚乙烯吡咯烷酮上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

UV-2550 型分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；湘仪H1650R 离心机 湘仪离心机仪器有限公司；L6S 紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 外源磷酸钠处理枣果实 挑选成熟度一致，大小和颜色均匀，无机械损伤和病虫害的三星枣果实。用预实验筛选的0.5 mg/mL 磷酸钠溶液（含0.01%Tween 20）浸泡果实5 min，以蒸馏水处理为对照。将果实风干后放入聚乙烯（PE）托盘中，在室温下（20±2 ℃，相对湿度75%±5%）保存待用。每组处理用果实210 个。参考葛永红等[17]的方法，分别于处理后第0、2、4、6、8、10 和12 d 果实去核，带皮切碎组织并在液氮中冷冻，然后放入-80 ℃冰箱中保存待用。每组处理每次用果实30 个。

1.2.2 过氧化氢（H2O2）含量测定 参考Liu 等[18]的方法并修改。精确称取1.0 g 冷冻组织，加入3.0 mL冷丙酮在冰浴条件下研磨成匀浆，然后低温（4 ℃）离心20 min（12000×g）。取2.0 mL 上清液，加入40 μL，20 mol/L 四氯化钛溶液和50 μL 浓氨水反应5 min，在相同条件下离心10 min。沉淀物用冷丙酮洗涤3 次后溶于3.0 mL，1.0 mol/L H2SO4溶液中，并在410 nm 下测定吸光度值。按照同样的方法，以吸光度为纵坐标，H2O2物质的量（μmol）为横坐标，制作H2O2标 准 曲 线（y=0.0063x+0.0208，R2=0.9952）。H2O2含量以μmol/g FW（鲜重）表示。

1.2.3 APX 活性测定 APX 粗酶液提取和活性测定参照Ge 等[14]的方法。取1.5 g 冷冻组织，液氮研磨成粉末，然后加入3.0 mL 磷酸缓冲液（pH7.5，0.1 mol/L）继续研磨成匀浆后在4 ℃、12000×g 条件下离心25 min 收集上清液。APX 反应体系包括2.0 mL 100 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.5），0.8 mL 3.0 mmol/L抗坏血酸，200 μL 粗酶液和0.5 mL 0.5 mmol/L H2O2。反应启动15 s 后测量混合液在290 nm 处的吸光度值，并连续测量2 min。以吸光度值每分钟变化0.01 为1 个酶活性单位（U），APX 活性以U/g FW表示。

1.2.4 GR 活性测定 GR 粗酶液提取和活性测定参照Ge 等[14]的方法。称取1.0 g 冷冻组织，液氮研磨成粉末，然后加入3.0 mL 磷酸缓冲液（pH7.5，0.1 mol/L）继续研磨成匀浆后在12000×g 条件下（4 ℃）离心25 min 收集上清液。GR 反应体系包括3.0 mL 磷酸钠缓冲液（100 mmol/L、pH7.5）、90 μL NADPH（3.0 mmol/L）、0.1 mL 氧化型谷胱甘肽（5.0 mmol/L）和0.6 mL 粗酶液。反应完成后测定混合液在340 nm处的吸光度。以340 nm 处吸光度值每分钟变化0.01 为1 个酶活性单位（U），GR 活性表示为U/g FW。

1.2.5 PAL 活性测定 PAL 粗酶液提取和活性测定参照Liu 等[19]的方法。称取冷冻组织1.5 g，液氮研磨成粉末后加入4.0 mL 硼酸缓冲液（100 mmol/L，pH8.8），继续磨成匀浆后静置提取20 min，最后在12000×g 条件下（4℃）离心20 min 收集上清液。PAL 反应体系包括0.5 mL 粗酶液、0.5 mL 苯丙氨酸溶液（0.02 mol/L）和3.0 mL 蒸馏水。混匀后于290 nm 处分别测定反应0 min 和反应40 min 的吸光度。以290 nm 处吸光值每分钟变化0.01 定义为1 个酶活性单位（U），PAL 活性以U/g FW 表示。

1.2.6 4CL 活性测定 4CL 粗酶液提取和活性测定参照Ren 等[20]的方法。称取冷冻组织2.0 g，加入4.0 mL 预冷的Tris-HCl 缓冲液（0.2 mol/L）磨成匀浆后暗处反应20 min，低温离心（12000×g）30 min 后收集上清液待测定。4CL 反应体系由0.15 mL 香豆酸（2.0 mmol/L）、0.15 mL 乙酰辅酶A（1.0 μmol/L）、0.15 mL 三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）（0.8 mmol/L）、0.45 mL 氯化镁（75 mmol/L）和1.5 mL粗酶液组成。酶活性以U/g FW 表示，将333 nm 处吸光值每分钟变化0.01 定义为1 个酶活性单位（U）。

1.2.7 POD 活性测定 参考葛永红等[17]的方法提取粗酶液和测定POD 活性。称取果肉组织1.5 g，加入4.0 mL 预冷的0.05 mol/L 磷酸钠提取液（pH7.5，内含1.0 mmol/L 聚乙二醇、2.0% 聚乙烯吡咯烷酮和0.01% Triton X-100），磨成匀浆后低温离心（12000×g）30 min 后收集上清液。反应体系包括2.5 mL、0.025 mol/L 的愈创木酚，0.2 mL、0.25 mol/L 的H2O2和0.2 mL 粗酶液。以470 nm 处吸光度值每分钟变化0.01 定义为1 个酶活性单位（U），POD 活性以U/g FW 表示。

1.2.8 总酚和类黄酮含量测定 参考Liu 等[18]的方法。称取1.0 g 磷酸钠处理和对照果肉组织，分别加入3.0 mL 预冷的1%盐酸-甲醇溶液，冰浴条件下充分研磨后在4 ℃、12000×g 离心10 min。取上清液分别测定280 nm 和325 nm 处吸光度值。用ΔOD280/g FW和ΔOD325/g FW 分别表示总酚和类黄酮含量。

1.3 数据处理

所有指标的测定均进行3 次生物学重复，全部实验数据用Microsoft Excel 2010 计算平均值和标准误差并作图，采用SPSS16.0 统计软件进行最小极差分析，以P＜0.05 表示对照和处理差异显著。

2 结果与分析

2.1 枣果实H2O2 含量的变化

活性氧爆发是果蔬遭受胁迫后作出的早期反应之一，果实体内积累的H2O2可以作为信号分子启动防卫反应，也可以参与木质素的合成过程，然而过量的H2O2又会导致细胞膜质过氧化，从而加速果实的衰老[21]。由图1 可知，对照果实H2O2含量在整个贮藏期间呈单峰变化趋势，在第8 d 达到最大，而磷酸钠处理果实H2O2含量呈双峰变化趋势，分别在贮藏第4 d 和10 d 出现峰值，分别比对照组高16.9%和18.7%。此外，磷酸钠处理显著（P＜0.05）促进了贮藏第2、4、8、10 和12 d 枣果实中H2O2含量的增加。苹果果实的研究也表明，采后磷酸钠处理诱导了果实中H2O2的积累，并且出现两个高峰[10]。因此，推测磷酸钠处理诱导果实中H2O2含量的升高可能是因为其诱抗作用促进H2O2的积累从而作为信号分子启动其它防卫反应的表达，而在后期明显上升可能是由于其参与了木质素的合成。

图1 采后磷酸钠处理对枣果实H2O2 含量的影响Fig.1 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on H2O2 content in jujube fruit

2.2 枣果实APX 活性的变化

APX 是抗坏血酸-还原型谷胱甘肽循环的关键酶，将电子从抗坏血酸转移到H2O2，并产生周期短的脱氢抗坏血酸和H2O，从而达到清除过量H2O2的目的[22]。由图2 可知，在整个贮藏期内，磷酸钠处理和对照果实的APX 活性均呈先升高后降低趋势，且磷酸钠处理果实均高于对照果实，同时在贮藏第4～12 d具有差异显著性（P＜0.05），分别是对照组APX 活性的1.17、1.21、1.15、1.26 和1.20 倍。Ge 等[10]研究发现，采后磷酸钠处理提高了苹果果实中APX 活性，有助于清除大量积累的H2O2，从而提高苹果果实的采后抗性。由此表明，磷酸钠处理枣果实能有效提高抗氧化酶活性并减轻膜脂过氧化反应，从而提高枣果实的抗病能力。

图2 采后磷酸钠处理对枣果实APX 活性的影响Fig.2 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on APX activity in jujube fruit

2.3 枣果实GR 活性的变化

GR 是抗坏血酸-还原型谷胱甘肽循环中的另外一个关键酶，依赖NADPH 催化谷胱甘肽，从而保持氧化性和还原性谷胱甘肽的稳定[22]。磷酸钠处理果实中GR 活性在贮藏第0～2 d 和6～8 d 上升，在第2～6 d 和8～12 d 下降；而对照果实GR 活性在贮藏第0～8 d 呈上升趋势，随后下降（图3）。磷酸钠处理显著提高了贮藏第2～8 d 枣果实中GR 活性，分别是对照果实的1.46、1.24、1.18 和1.28 倍（P＜0.05）。Ge等[10]研究发现，采后磷酸钠处理提高了苹果果实中GR 活性，并且出现了一个高峰，而本实验结果表明，磷酸钠诱导枣果实中出现两个GR 活性高峰。分析其原因可能是由于贮藏后期H2O2含量增加，为了保证抗坏血酸-还原型谷胱甘肽循环对H2O2的清除效率和谷胱甘肽平衡，GR 活性再次被诱导升高。由此说明，外源磷酸钠处理能够提高枣果实常温贮藏期间的GR 活性，从而保持氧化性和还原性谷胱甘肽的平衡，但在不同的果蔬中磷酸钠诱导的抗性反应有差异。

图3 采后磷酸钠处理对枣果实GR 活性的影响Fig.3 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on GR activity in jujube fruit

2.4 枣果实PAL 活性的变化

PAL 是苯丙烷代谢的限速酶，调控下游次生代谢产物酚类、木质素、生物碱等的合成，与果实抗病性密切相关[23]。由图4 可知，对照和磷酸钠处理果实中PAL 活性在贮藏第0～12 d 呈先升高后降低趋势，并且在第6 d 达到高峰值。磷酸钠处理显著提高了贮藏第4、6 和8 d 枣果实PAL 活性，分别是对照的1.08、1.18 和1.11 倍（P＜0.05）。已有研究表明，采后磷酸钠能够诱导苹果果实中PAL 活性的升高，同时提高其对黑斑病的抗性[10]。由此可见，磷酸钠处理能够提高果实中PAL 活性并激活苯丙烷代谢途径。

图4 采后磷酸钠处理对枣果实PAL 活性的影响Fig.4 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on PAL activity in jujube fruit

2.5 枣果实4CL 活性的变化

4CL 是苯丙烷代谢下游分支的关键酶之一，催化阿魏酸、对香豆酸、肉桂酸和咖啡酸转化为对香豆酰-辅酶A[24]。由图5 可以看出，随着贮藏时间的延长，磷酸钠处理与对照果实4CL 活性均呈先上升后下降趋势，二者均在第8 d 达到高峰值。与对照相比，磷酸钠处理果实的4CL 活性均保持较高水平，并且在贮藏第4～12 d 差异显著，分别是对照果实的1.10、1.06、1.16、1.25 和1.16 倍（P＜0.05）。冬枣果实中的研究表明，诱抗剂处理激活了4CL 活性，并且促进了下游产物的积累，从而提高果实的抗性[25]。这些结果表明，促进4CL 活性的升高是磷酸钠诱导枣果实产生抗性的机理之一。

图5 采后磷酸钠处理对枣果实4CL 活性的影响Fig.5 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on 4CL activity in jujube fruit

2.6 枣果实POD 活性的变化

POD 具有多种同工酶，可以清除寄主体内过量积累的H2O2，也是木质素生物合成的关键酶[24]。由图6 可知，磷酸钠处理枣果实POD 活性始终高于对照果实，在贮藏第4～10 d 差异显著，对照果实POD活性为磷酸钠处理果实的83.8%、80.4%、71.2%和93.1%（P＜0.05）。苹果中的研究证明，采后磷酸钠浸泡处理诱导了果实中POD 活性的升高，并且呈单峰变化趋势[10]。冬枣果实的研究也发现了类似的结果[25]。由此说明，磷酸钠处理能够提高枣果实贮藏期间POD 活性。

图6 采后磷酸钠处理对枣果实POD 活性的影响Fig.6 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on POD activity in jujube fruit

2.7 枣果实总酚和类黄酮含量的变化

酚类和类黄酮是苯丙烷代谢的主要产物，在果实抗病过程中具有重要作用，二者不仅能够直接抑制病原真菌的生长，还能强化寄主细胞壁提高对病原真菌侵染的抵抗能力[26]。在整个贮藏期间，磷酸钠处理枣果实总酚含量始终高于对照果实，且在贮藏第8 d达到峰值（图7A），其中，6～12 d 磷酸钠处理果实总酚含量显著高于对照果实，分别为对照果实的1.19、1.38、1.26 和1.24 倍（P＜0.05）。磷酸钠处理与对照枣果实中类黄酮含量在贮藏期内缓慢上升，且均在贮藏第10 d 达到峰值（图7B）。相较于对照组果实，磷酸钠处理在贮藏第6～12 d 显著促进了类黄酮的积累，分别为对照组的1.14、1.15、1.29 和1.25 倍（P＜0.05）。Ge 等[10]研究发现，采后磷酸钠处理提高了苹果果实中总酚和类黄酮含量，并且呈单峰变化趋势。此外，冬枣果实中的研究也证明，采后诱抗剂处理能够促进总酚和类黄酮的积累[25]。由此可知，磷酸钠处理能够提高枣果实常温贮藏期间次生代谢产物总酚与类黄酮的积累。

图7 采后磷酸钠处理对枣果实总酚（A）和类黄酮（B）含量的影响Fig.7 Effects of postharvest trisodium phosphate treatment on the contents of total phenolic compounds (A) and flavonoids (B)in jujube fruit

3 结论

采后0.5 mg/mL 磷酸钠浸泡能诱导枣果实中H2O2的积累，并且呈双峰变化趋势，同时显著提高了果实APX 和GR 活性（P＜0.05）。磷酸钠提高了果实PAL、POD和4CL 活性，分别在贮藏第6、8 和8 d出现高峰，这些酶活性的升高显著促进了总酚和类黄酮的积累（P＜0.05）。由此说明，采后外源磷酸钠处理能够激活枣果实活性氧清除酶的活性，促进苯丙烷代谢关键酶活性和酚类物质的积累。