泼墨石斛高位芽组培快繁体系的建立

龚建英 王华新 陈宝玲 唐遒冥 蒙芳 苏莉花

摘要：【目的】建立泼墨石斛（Dendrobium Enobi Purple ‘Splashi’）高位芽组培快繁体系，为减少其无菌播种引起的子代植株花色性状分离提供技术支持。【方法】以泼墨石斛侧芽、高位芽和花梗为外植体，分析不同消毒时间对其不定芽诱导率的影响;以高位芽为外植体，分析不同激素组合对其不定芽诱导、丛生芽增殖及生根壮苗效果的影响。【结果】泼墨石斛高位芽的不定芽诱导效果优于侧芽和花梗，其中以0.1% HgCl2消毒2.5 min时的不定芽诱导率最高;以高位芽进行不定芽诱导的最佳培养基为MS+3.00 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.50 mg/L α-萘乙酸（NAA）+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性炭+100.0 mL/L椰汁，诱导率达73.3%;最佳增殖培养基为MS+4.00 mg/L NAA+0.20 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性碳+100.0 g/L土豆泥，增殖倍数达5.0倍;最佳生根壮苗培养基为MS+0.50 mg/L NAA+0.10 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性碳+50.0 g/L香蕉泥+30.0 g/L土豆泥，平均株高7.30 cm，茎粗0.990 cm，生根数16条，根長6.10 cm，根粗0.140 cm;生根苗用水苔包裹根部后移栽至穴盘中，成活率达100.0%;以高位芽进行诱导获得的泼墨石斛再生植株，可保持其品种的典型泼墨花色特征。【结论】以高位芽为外植体建立的泼墨石斛组培快繁体系能同时实现种苗快繁和保持品种优良花色性状，可用于其种苗工厂化育苗。

关键词： 泼墨石斛;外植体;高位芽;消毒时间;组培快繁

中图分类号： S682.31                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0125-06

0 引言

【研究意义】泼墨石斛（Dendrobium Enobi Purple ‘Splashi’）是我国近年从泰国或日本引进的石斛兰新品种，属迷你型秋石斛种类，株高20.00～30.00 cm，花瓣和萼片呈白色，其边缘镶嵌紫红色花斑，唇瓣白色带紫红色条纹，每株开花10～30朵，花径6.00～8.00 cm，自然花期为5月或9月，群体花期45～60 d。泼墨石斛由于发生花色突变，其花朵上的大部分部位失去紫红色素，从而形成类似国画中泼墨效果的变异花色（王雁等，2015），是当前不可多得的精品盆栽石斛兰。泼墨石斛引入我国时间较短，当前仅海南和广东等地有少量种植，其繁殖方式主要为分株繁殖，繁殖效率低，无法满足市场需求。笔者经前期试验发现，泼墨石斛无菌播种极易引起花色性状分离，子代植株的花朵变为普通的白花或红花，观赏价值和经济价值显著下降。因此，建立泼墨石斛组培快繁体系繁育种苗，对解决其无菌播种引起的子代植株花色性状分离及分株繁殖效率低等问题具有重要意义。【前人研究进展】国内在秋石斛组织培养方面已有一些研究报道。罗岚等（2004）以秋石斛小苗的茎尖为材料进行离体繁殖，结果显示，自制培养基NX+1.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.15 mg/L α-萘乙酸（NAA）为较佳的秋石斛原球茎诱导培养基，诱导率达57.7%，自制培养基NX+1.5 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA为较佳的秋石斛原球茎增殖培养基，培养35 d可增殖7.52倍。陈亚鸿等（2009）研究显示，在含不同配比激素的MS培养基中添加0.5～1.0 g/L活性炭（AC）和0.5～1.0 g/L胰蛋白胨进行秋石斛原球茎增殖、芽分化和生根培养，能降低其组培苗的褐化率。张娟（2015）以秋石斛品种阳光的高位芽为外植体开展组织培养研究，发现最佳不定芽诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 3-吲哚丁酸（IBA）+80.0 g/L土豆泥+1.0 g/L活性炭，增殖系数达4.50;最佳生根壮苗培养基为MS+0.8 mg/L IBA+80.0 g/L土豆泥+活性炭1.0 g/L，生根率达99.0%。陈齐明等（2017）研究发现，秋石斛三亚阳光侧芽茎尖的最佳诱导培养基为MS+0.3 mg/L 6-BA，诱导率达92.86%;继代增殖最佳培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+30.0 g/L葡萄糖，增殖系数达8.15。莫远琪等（2018）以澳洲鸽子石斛幼嫩假鳞茎为外植体进行组织培养和快速繁殖研究，结果表明，外植体消毒成功率达92.5%，在MS培养基中添加5.0 mg/L 6-BA适用于进行不定芽诱导和前期增殖，而在MS+0.50 mg/L NAA+2.0 mg/L KT中增殖倍数最大，为6.96倍。【本研究切入点】秋石斛组培快繁体系的建立主要以茎尖和侧芽为外植体，但秋石斛品种繁多，不同品种和试验材料的最佳培养基配方差异明显，目前关于系统比较以泼墨石斛侧芽、高位芽和花梗为外植体诱导不定芽的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】利用泼墨石斛高位芽、侧芽和花梗为外植体，比较不同消毒时间对泼墨石斛不定芽诱导效果的影响;在此基础上，以高位芽为外植体建立泼墨石斛组培快繁体系，为泼墨石斛种苗的规模化繁殖打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

泼墨石斛由广西林业科学研究院国家石斛属种质资源保存库提供。于2017年5月的睛天上午，在无病虫害、生长健壮泼墨石斛植株上选取高位芽、侧芽和花梗，剥去叶片或花蕾，用洗洁精洗净，以流水冲洗20 min，置于超净工作台上用滤纸吸干表面水分，用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗4次，接着用0.1% HgCl2溶液消毒1～4 min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分备用。

以MS为基本培养基，添加30.0 g/L蔗糖、5.0 g/L琼脂、2.0 g/L蛋白胨和0.5 g/L活性碳;在诱导培养基中添加100.0 mL/L椰汁，在增殖培养基中添加100.0 g/L土豆泥，在生根壮苗培养基中添加50.0 mg/L香蕉泥和30.0.0 mg/L土豆泥;培养基pH 5.6～5.8;光照时间12 h/d，光照强度2000～3000 lx，培养温度23～25 ℃。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 泼墨石斛外植体及其消毒时间筛选 以泼墨石斛侧芽、高位芽和花梗3种材料为外植体，设0.1% HgCl2消毒时间为1.0、1.5、2.5和4.0 min，共12个处理，每处理15瓶，每瓶2个外植体，重复3次。外植体切成1.5 cm左右的小段，接种于激素组合为2.00～4.00 mg/L 6-BA+0.20～0.50 mg/L NAA的诱导培养基中，培养30 d后统计不定芽诱导率，筛选出最佳外植体和外植体消毒时间。

1. 2. 2 泼墨石斛不定芽诱导最佳激素组合和培养基筛选 将消毒好的高位芽切成1.5 cm左右的带节茎段，接种于分别添加不同质量浓度6-BA（1.00、2.00、3.00、5.00 mg/L）和NAA（0.20、0.50、1.00 mg/L）的诱导培养基中，共12个处理组合。每处理15瓶，每瓶接种2个外植体，重复3次。诱导培养30 d后统计不定芽诱导率，筛选出诱导不定芽的最佳激素组合和培养基。

1. 2. 3 泼墨石斛丛生芽增殖最佳激素组合和培养基筛选 当诱导出的不定芽长至2～4 cm时，从其基部切下，接种于分别添加不同质量浓度NAA（1.00、2.00、3.00、4.00 mg/L）和6-BA（0.05、0.20、0.50 mg/L）的增殖培养基中，共12个处理组合。每处理30瓶，每瓶接种1个不定芽，重复3次。培养75 d后统计芽的增殖倍数，筛选出丛生芽增殖的最佳激素组合和培养基。

1. 2. 4 泼墨石斛生根壮苗最佳激素组合和培养基筛选 当增殖的丛生芽有3～4片叶、高度达4.0 cm左右时，从基部切下，将生长较好、长势一致的单株接种于激素组合分别为2.00 mg/L NAA+（0.05、0.20、0.50 mg/L）6-BA、3.00 mg/L 6-BA+（0.05、0.20、0.50 mg/L）NAA、0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA和0.50 mg/L NAA+0.10 mg/L 6-BA的生根壮苗培养基中，共8个处理组合。每处理8瓶，每瓶接种5个单株，重复3次。培养75 d后统计生根苗的株高、茎粗、根数、根长和根粗，筛选出生根壮苗的最佳激素组合和培养基。

1. 2. 5 泼墨石斛组培苗移栽 将泼墨石斛组培瓶苗（生根苗）置于温室中炼苗7～15 d后，清水洗净根部培养基，用80%多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸泡植株10～15 min，将小苗捞出，沥干水分后用水苔包裹根颈移栽至50孔穴盘中，30 d后统计成活率。移栽植株自然开花时，逐株观察其花色特征。

1. 2. 6 测定指标及方法 不定芽诱导率（%）=（诱导芽数/接种芽数）×100;外植体污染率（%）=（污染芽数/接种芽数）×100;增殖倍数=丛生芽数/接种芽数;移栽苗成活率（%）=（成活苗数/移栽苗数）×100。以游标卡尺测定根长、根粗和茎粗，以直尺测定株高。

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2007和DPS v9.01进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 不同外植体和消毒时间对泼墨石斛不定芽诱导效果的影响

由表1可知，泼墨石斛高位芽和侧芽均可直接诱导出单生不定芽，花梗可诱导出愈伤组织;同一消毒时间，花梗的污染率最低，高位芽次之，侧芽的最高，说明花梗更容易消毒;同一外植体，随0.1% HgCl2消毒时间的增加，其不定芽诱导率呈先上升后下降的变化趋势，污染率持续降低;12个处理组合中，消毒时间为2.5 min时，高位芽的不定芽诱导率最高，为61.1%，显著高于其他消毒时间处理的高位芽、侧芽和花梗（P<0.05，下同），污染率也较低（16.7%）。说明以泼墨石斛高位芽为外植体进行不定芽诱导的效果优于侧芽和花梗，其中以0.1% HgCl2消毒2.5 min的泼墨石斛高位芽诱导效果最佳。

2. 2 不同激素组合对泼墨石斛不定芽诱导效果的影响

由表2可知，在12个激素处理组合中，处理组合5的不定芽诱导率最高，为73.3%，与处理组合8（66.7%）差异不显著（P>0.05，下同），但二者显著高于其他10个处理组合。在同一质量浓度6-BA的处理组合中，随着NAA质量浓度由0.20 mg/L增加至1.00 mg/L，泼墨石斛不定芽诱导率呈先增加后降低的变化趋势，当NAA质量浓度增加至1.00 mg/L时，诱导出的不定芽均发生了变异。在同一质量浓度NAA处理中，随着6-BA质量浓度由2.00 mg/L增加至5.00 mg/L，不定芽诱导率也呈先增加后降低的变化趋势;当6-BA质量浓度增至5.00 mg/L时，处理组合10～12的芽诱导率均较处理组合7～9（4.00 mg/L 6-BA处理组合）显著下降。由此可见，6-BA质量浓度升至5.00 mg/L和NAA质量浓度升至1.00 mg/L均会抑制泼墨石斛不定芽生长。即泼墨石斛最佳不定芽诱导培养基为MS+3.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性碳+100.0 ml/L椰汁（不定芽诱导情况见图1-A）。

2. 3 不同激素组合对泼墨石斛丛生芽增殖效果的影响

由表3可知，12个激素处理组合泼墨石斛丛生芽的增殖系数为1.25～5.00;其中处理组合11的增殖效果最佳，增殖系数为5.00，显著高于其他11个处理组合。当NAA质量浓度为1.00～3.00 mg/L时，随着6-BA质量浓度由0.05 mg/L增加至0.50 mg/L，叢生芽增殖系数逐步增加;当NAA质量浓度为4.00 mg/L时，随6-BA质量浓度的增加，丛生芽增殖系数呈先增加后减少的变化趋势，当6-BA质量浓度为0.20 mg/L时，丛生芽增殖系数最大，为5.00。同一质量浓度6-BA的处理组合中，随着NAA质量浓度由1.00 mg/L增加至4.00 mg/L，丛生芽增殖系数增加。由此可见，在适宜的激素浓度范围内，高质量浓度NAA与低质量浓度6-BA组合更有利于泼墨石斛增殖。根据丛生芽增殖系数判断，筛选出MS+4.00 mg/L NAA+0.20 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性碳+100.0 g/L土豆泥为泼墨石斛最佳丛生芽增殖培养基（丛生芽增殖情况见图1-B）。

2. 4 不同激素组合对泼墨石斛生根壮苗效果的影响

由表4可知，8个激素处理组合泼墨石斛的生根数为14～24条，相互间差异不显著。处理组合4的株高最高（9.40 cm），处理组合3的生根数（24条）最多，处理组合7的株高、茎粗、根数、根长和根粗与处理组合8差异不显著，二者的壮苗与生根效果均较佳。说明高质量浓度（3.00 mg/L）6-BA与低质量浓度（0.05 mg/L）NAA组合对泼墨石斛的株高生长有利，但植株假鳞茎偏细（茎粗仅0.590 cm）;高质量浓度（2.00 mg/L）NAA与低质量浓度（0.50 mg/L）6-BA组合有利于泼墨石斛根系分蘖（根数24条），而低质量浓度（0.50和0.10 mg/L）6-BA和低质量浓度（0.10和0.50 mg/L）NAA组合有利于泼墨石斛生根和壮苗，如处理组合7的茎粗达0.986 cm，根数为22条，处理组合8的茎粗达0.990 cm，根数为16条。综合泼墨石斛的5项生长指标及其植株整体长势，以处理组合8的生根壮苗效果最佳，其株高为7.30 cm，茎粗为0.990 cm，生根数为16 条，根长为6.10 cm，根粗为0.140 cm。即MS+0.50 mg/L NAA+0.10 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性碳+50.0 g/L香蕉泥+30.0 g/L土豆泥为泼墨石斛最佳生根壮苗培养基（壮苗生根情况见图1-C和图1-D）。

2. 5 泼墨石斛组培苗移栽及观察

将苗高5.00～7.00 cm、茎粗≥0.40 cm、根数≥10条的泼墨石斛组培瓶苗经炼苗后移栽至穴盘中，在温度20～30 ℃、相对湿度70%～80%、遮光度50%～75%的条件下培育，小苗长出新芽后，每隔7～10 d叶面喷施0.05%～0.10%水溶性复合肥（N∶P∶K=30∶10∶10或20∶20∶20）1次。移栽2周后浇透水，1个月后视天气情况浇水，干燥天气每2～3 d浇1次，阴天每5～7 d浇1次。45 d后，统计移栽成活率达100.0%（图1-E）。移栽后经1年培育获得的泼墨石斛组培苗生长健壮，能自然开花，其花色未发生变异，保持了该品种的典型泼墨花色特征（开花株情况见图1-F）。

3 讨论

在石斛兰组培快繁方面，国内研究人员已通过茎尖、茎段等外植体诱导原球茎的途径，建立了多个石斛品种的再生体系（汪杰等，2009;贺佳等，2010;张彦妮等，2010;陆顺教等，2017）。泼墨石斛属于精品盆栽迷你型秋石斛，花色独特，观赏价值极高，但其花色易受繁殖方式影响而发生变化。目前，通过分株繁殖，泼墨石斛子代植株可保持其典型的花色特征，但繁殖效率低，无法满足市场需求;通过无菌播种繁殖，其子代植株会丧失花色的泼墨特征，观赏价值和经济价值显著下降;以茎尖和茎段为外植体诱导原球茎途径获得的再生植株，在培养过程中幼芽变异率较高，石斛兰的优良性状不易保持（陆顺教等，2017）;以石斛兰花梗为外植体诱导不定芽的文献报道较少。

易双双等（2016）对树兰的研究结果表明，通过顶芽或腋芽诱导产生不定芽，能较好地保持亲本的优良性状，其体细胞的变异率低，遗传稳定。为减少组培苗的花色变异，本研究采用与易双双等（2014，2016）的相似策略建立泼墨石斛组培快繁体系，其中，高位芽和侧芽均有较高的不定芽诱导率，但高位芽污染率（16.7%）显著低于侧芽（30.0%），因此确定以高位芽为最适宜的组培外植体，并在激素组合为3.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L  NAA的不定芽诱导培养基中获得最高不定芽诱导率，在激素组合为4.00 mg/L NAA+0.20 mg/L 6-BA的增殖培养基中获得最高丛生芽增殖系数，在激素组合为0.50 mg/L NAA+0.10 mg/L 6-BA的生根壮苗培养基中获得最佳生根壮苗效果。以高位芽为外植体培育的泼墨石斛组培苗移栽后生长良好，能正常开花，且能保持泼墨石斛的典型花色性状。说明本研究构建的泼墨石斛高位芽组培快繁体系能实现种苗快繁和保持品种优良花色性状的双重目标。

本研究结果表明，高质量浓度（3.00 mg/L）6-BA与低质量浓度（0.50 mg/L）NAA组合有利于泼墨石斛不定芽诱导，与贺佳等（2010）的研究结果一致。本研究还发现，高质量浓度（4.00 mg/L）NAA与低质量浓度（0.20 mg/L）6-BA组合有利于泼墨石斛丛生芽增殖，增殖倍数达5.00倍，略高于陆顺教等（2015）的研究结果（4.75倍）。低质量浓度（0.50 mg/L）NAA和低质量浓度（0.10 mg/L）6-BA组合有助于提高组培苗质量，其株高、茎粗、根数和根长分别为7.30 cm、0.990 cm、16条和6.10 cm，优于陆顺教等（2015）单独以0.70 mg/L NAA处理的生根壮苗效果（4.18 cm、0.410 cm、12条和3.50 cm）。

4 结论

高位芽是泼墨石斛组培快繁的适宜外植体，其最佳不定芽诱导培养基为MS+3.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性炭+100.0 mL/L椰汁，最佳增殖培養基为MS+4.00 mg/L NAA+0.20 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性碳+100.0 g/L土豆泥，最佳生根壮苗培养基为MS+0.50 mg/L NAA+0.10 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂+2.0 g/L蛋白胨+0.5 g/L活性碳+50.0 g/L香蕉泥+30.0 g/L土豆泥;经炼苗后的组培瓶苗用水苔包裹根部移栽至穴盘中，成活率达100.0%，生长正常，能自然开花，且花色性状保持典型的泼墨特征。因此，以高位芽为外植体建立的泼墨石斛组培快繁体系可用于泼墨石斛种苗快繁与工厂化育苗。

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（责任编辑 思利华）