园林植物报春花的组织培养

胡万银

摘    要：本试验以报春花叶片、茎段作为外植体，进行了初代组织培养，并进行增殖、生根培养。结果表明：75%的酒精（0.5 min）+0.1%升汞（8 min）具有很好的消毒作用;MS +6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1是不定芽分化的最佳培养基配比;MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1是不定芽增殖的最佳培养基配比;1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1是生根的最佳培养基配比。

关键词：报春花;外植体;培养基

中图分类号：S688         文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.036

Tissue Culture of Primula malacoides Franch.

HU Wan-yin

（Tree Breeding Research Center of Shanxi Province，Taiyuan， Shanxi 030006 ， China）

Abstract： In this experiment， leaves and stems of Primula malacoides Franch. were taken as explants， and conducted the primary tissue culture， and proliferation， rooting culture. The results showed that 75% alcohol （0.5 min） 0.1% mercuric chloride （8 min） had good disinfection effect; the best medium ratio for the differentiation of adventitious buds was MS +6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1; for adventitious bud proliferation， the optimum culture medium composition was MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1; 1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1 was the best rooting culture medium composition.

Key words： Primula malacoides Franch.; explants; callus culture medium

报春花 （Primula malacoides Franch.）又名小种樱草、七重楼，报春花科报春花属，叶片长卵形或圆形，叶缘有齿，叶柄长5 cm左右。花葶高20～30 cm，花冠高脚碟状。多生长于荒野、田边，原产于中国的云南、贵州，各地栽培，颇具观赏性。

报春花原产中国，草本植物。喜气候温凉、湿润的环境和排水良好、富含腐殖质的土壤，不耐高温和强烈的直射阳光，多数亦不耐严寒。叶基生，全株被白色绒毛。花通常2型，排成伞形花序或头状花序。花期为12月至次年4月，早春开花为本属植物的重要特性，其中文名报春和学名均含有早花的意思。近年来发展很快，已成为当前一类重要的园林花卉。

组织培养又叫离体培养，通常指从植物体中分离出符合需求的组织（器官、细胞、原生质体等），在人工无菌操作条件下，进行培养从而获得再生的完整植株，或者生产出具有经济价值的其他产品的技术。本试验以报春花叶片、茎段为外植体，进行了初代组织培养，并进行增殖、生根培养，在建立报春花组织培养无菌体系的基础上，对比了外植体不同灭菌方法对灭菌效果的影响，以及不同激素浓度对报春花叶片、茎段芽分化、不定芽增殖及其生根的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

使用材料取自盆栽报春花的叶片和茎段。

1.2 试验材料的处理

组织培养前，先从室内培养的盆栽植株上取生长旺盛的报春花叶片和嫩茎作外植体，取材后放入烧杯里，用大量的水洗去表面附着物后，再放到自来水管下进行二次冲洗（时间约60 min），然后放入到瓶中，在超净工作台上再迅速用无菌蒸馏水冲洗3遍后等分为2份。每种消毒剂处理15瓶，每瓶接种4块，处理方法见表1。最后，用无菌蒸馏水冲洗6次。将叶片横切和纵切后切成1 cm×1 cm大小，将嫩茎切成1 cm左右的茎段作外植体用。

1.3 培养基配比

基本培养基为MS，琼脂为6 g，蔗糖浓度为3%，pH 值为5.8。初代培养基为：（1）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（2）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;（3）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（4）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;（5）MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（6）MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。增殖培养基为：（7）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（8）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。生根培养基为：（9）1/2MS+NAA  0.1 mg·L-1;（10）1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1。培养室内温度为（25±2） ℃，光照强度1 500～2 000 lx，每天光照12 h，补光灯在光照不够的条件下及时补光。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂处理的消毒效果

进行初代培养10 d后对120瓶培养情况进行统计，结果见表2。处理Ⅰ、处理Ⅱ的消毒效果差异明显，处理Ⅱ的消毒效果是处理Ⅰ的17倍，因此单独使用酒精对报春花外植体进行消毒处理，污染率高，效果不太好;而用70%酒精（0.6 min）+0.1%HgCl2（10 min）对报春花外植体消毒效果明显。

2.2 不同外植体诱导愈伤组织的时间

经过初代培养10 d后，对每种培养基中茎段和叶片愈伤组织形成情况进行统计，从表3可看出，由于培养基配比不同，如果培养基配比合适，报春花叶片在第11天就可以形成愈伤组织，而茎段需要在第15天左右才能形成，其诱导时间比用叶片作为外植体的时间要长约4 d左右。

2.3 激素对初代培养的影响

将经过消毒组合Ⅱ处理好的外植体接种到初代培养基1～6，培养11 d后，大部分叶片的切块边缘首先开始膨大，长出淡绿色的愈伤组织，并呈疏松的颗粒状，有部分叶片在切口处直接产生不定芽;接种20 d后愈伤组织表面出现绿色芽点，开始分化出0.2～0.5 cm的不定芽，35 d后顶芽萌动并长出侧芽和分枝。

表4是第36天出芽的外植体统计数，激素的影响由表4中可以看出。在培养过程中还发现，当6-BA 2.0 mg·L-1、NAA0.1 mg·L-1时，在后期出现部分芽苗玻璃化、失绿现象;当NAA 0.2 mg·L-1、6-BA 2.0 mg·L-1时，分化出的不定芽形态明显弱小;当6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1时，诱导率较高，而且芽苗生长健壮，芽苗利用率也好。因此，初代培养的最适培养基配比为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

2.4 激素对增殖培养的影响

将初代培养得到的芽丛和分枝切割成带1～2个节的小段，转接到培养基7～8上，约15 d后，就可以不断长出大量的芽和分枝，培养基7和8中的芽都有增殖，但是培养基配比8的效果好，分化丛生芽芽体健壮，数量多，长势良好，适合叶、茎段的继代培养。当NAA为0.1 mg·L-1时，有部分芽生长良好，但部分芽体长势较略差，长不高，影响丛生芽的大量继代增殖（表5）。

2.5 激素对生根培养的影响

切取分化增殖所得到的高约2～3 cm生长健壮的丛生芽苗，将分枝切成带有2个节的茎段，转接种到添加不同浓度NAA的生根培养基9～10中。在生根培养进行到第30天的时候，对丛生芽的生根情况进行了统计，结果见表6。

当在1/2MS基本培养基中添加NAA浓度为0.1 mg·L-1（培养基9）时，生根率为85.0%，平均生根数达到12.6条，根长为1. 0 cm左右。当添加NAA浓度为0.2 mg·L-1（培养基10）后，诱导的丛生芽生根率升高，达到97.5%，平均生根数有13.8条左右，并且根粗壮，苗长势良好，根长为1.4 cm左右。

3 结论与讨论

由于报春花叶片肉质光滑，易于表面灭菌消毒，无菌操作简单，切割过程也容易操作，瓶苗移栽后管理较粗放，组培繁殖极易见效率，经济效益亦是可观的。

因为植物体表面常附有各种各样的微生物，无菌操作过程中，对于植物材料表面的消毒尤为重要，因为一旦带进培养基，微生物就会迅速滋生造成植物材料死亡。75%酒精（0.5 min）+0.1%HgCl2（8 min）的消毒处理有更强的杀菌能力和穿透力，而且有湿润作用，对报春花叶片和茎段的消毒处理效果明显。

植物激素的种类和配比，是使植物组织分化出苗和快速增殖的重要因素，通过此次不同梯度培养基配比，发现虽然都能使植物分化出苗和增殖，但是低浓度和高浓度的激素配比使植物分化出苗较慢，同时细胞分裂素和生长素比例过高，导致玻璃化苗的产生，其中MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1激素配比最佳，利于报春花愈伤组织的生长和分化，进行初代培养;MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1是最有利于增殖的培养基;最适生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1。

参考文献：

[1] 王春杰. 西藏色季拉山报春花属植物及其根际土壤营养元素积累研究[D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学， 2012.

[2] 黄祯强. 7种报春花属植物温室越夏栽培研究[D].北京：北京林业大学，2010.

[3] 张骞. 四川省报春花属植物资源调查及两种报春的栽培繁殖研究[D].北京 ：北京林业大学，2008.

[4] 文艺. 滇西北报春花属植物资源考察及两种野生报春花的栽培研究[D].北京：北京林业大学，2004.

[5] 李银莲. 西藏色季拉山野生报春花属与杜鹃属植物生境土壤与其体内养分含量相关性研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2013.

[6] 禄鑫.高温胁迫对报春花叶片细胞膜透性的影响[J].天津农业科学，2012（2）：140-141.