茬口及栽培环境对香椿黄酮含量和清除DPPH能力的影响

王赵改+王晓敏+杨慧+张乐+史冠莹+王继红+梁万平

摘    要：以国内主栽品种红油香椿为研究对象，在提取方法及溶剂选择的基础上，研究不同茬口及栽培环境对香椿不同部位黄酮含量和DPPH自由基清除活性的影响。结果表明：以70%乙醇为提取溶剂，采用微波法提取黄酮效果较好。头茬香椿不同部位的黄酮含量及DPPH自由基清除活性均高于二茬香椿，露地栽培香椿不同部位的黄酮含量及DPPH自由基清除活性均高于大棚栽培。香椿嫩芽及嫩茎等幼嫩组织均不及香椿老叶及老茎部分。

关键词：香椿;茬口;栽培环境;黄酮;DPPH清除能力

中图分类号：S644.4         文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.011

Effects of Different Crops and Cultivation Environment on Flavonoids Contents and DPPH-Scavenging Capacities of Toona sinensis

WANG Zhao-gai1， WANG Xiao-min1， YANG Hui1， ZHANG Le1，  SHI Guan-ying1， WANG Ji-hong1， LIANG Wan-ping2

（1. Institute of Agricultural Products Processing， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， Henan 450008，China; 2. Institute of Resources and Environment， Zhumadian City of Agricultural Sciences， Zhumadian， Henan 463000，China）

Abstract： "Hongyou" Chinese toon （Toona sinensis）， the major cultivar in China， was used to investigate the effects of different crops and cultivation environment on flavonoid content and DPPH-scavenging capacities of Toona sinensis in different parts on the basis of selected extraction method and solvent. The results showed that with 70% ethanol as the extraction solvent， the microwave extraction had some slightly advantages of higher extraction yields and DPPH-scavenging capacities. The contents of flavonoids and DPPH-scavenging capacities in different parts of Toona sinensis in the first crop were higher than those in the second crop， and which cultivated outside were higher than those cultivated in greenhouse. Furthermore， the contents of flavonoids and DPPH-scavenging capacities in tender buds and stems were lower than those in old leaves and stems.

Key words： Toona sinensis; crops; cultivation environment; flavonoids; DPPH-scavenging capacity

香椿（Toona sinensis（A. Juss.）Roem），为楝科香椿属的多年生落叶乔木[1-2]，是我国特有的集材、菜、药为一体的珍贵树种，分布于全国各地，尤以河南、山东、河北和安徽等地栽培居多。香椿富含人体所必须的氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素等多种营养物质以及黄酮、多酚、皂苷、生物碱等活性成分[3-5]，具有很高的营养保健价值，且在生长过程中能够分泌驱虫物质，无需喷施农药，是名副其实的绿色蔬菜[6]。在食品安全与健康问题成为当前国内外日益关注焦点的背景下，香椿的绿色、营养、保健等优点迎合了现代人追求健康饮食时尚的新潮流，深受国人的喜爱，并成为美国、德国、日本及东南亚等国家的新宠，具有很大的国际市场开发潜力[7]，同时，依靠传统的天然采集方式已不能满足香椿消费需求，集约化栽培和保护地栽培正逐渐兴起。

目前，对香椿的研究多集中在品种选育、栽培技术、贮藏保鲜及加工技术等方面[8]，而关于香椿中黄酮类活性物质仍缺乏系统的研究，由于香椿具有明显的生长季节性和环境差异性，不同茬口和不同栽培环境下香椿所含的黄酮类活性物质的含量及抗氧化性能也会有一定差异。同时，香椿目前的消费多以嫩芽为主，而大量的老叶及木质化枝条等老化组织常被废弃，造成大量的资源浪费及严重的环境污染。为此，本试验以红油香椿为研究对象，对不同茬口及不同栽培环境的香椿嫩芽、老叶、嫩茎及老茎的黄酮含量和DPPH自由基清除活性进行系统地分析比较，以明确香椿中黄酮类物质在不同生长条件下的空间积累分布情况和活性特征，以期为香椿的综合加工利用及功能成分的深入研究提供理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

香椿品种为大棚栽培及露地栽培红油香椿，分别于2015年1月5日、20日及4月20日、5月5日采收于河南省郑州市中牟县田庄村河南省农业科学院香椿示范基地，分别记为头茬和二茬。每茬香椿又分为嫩芽、老叶及嫩茎和老茎，其感官特征分别为：香椿嫩芽与嫩茎长度均选取10 cm、无木质化可鲜食;老叶、老茎为完全木质化不可鲜食。新采摘的香椿于室温阴凉处晾干，粉碎，过孔径为0.40 mm筛，备用。

芦丁标准品，Beijing Solarbio Science & Technology Limited Company;DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl），东京化成工业株式会社;硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、无水乙醇等，烟台市双双化工有限公司;Vc标准品，天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

BL-250A型高速多功能粉碎机，浙江省永康市松青五金厂;ME204E型电子天平，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司;G70F20CN3L-C2（B0）型微波炉，广东格兰仕微波炉电器制造有限公司;SB-5200DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司;NUⅡ-10T型实验室（超）纯水机，南京优普环保设备有限公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司;HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;QL-901型Vortex，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;玻璃仪器气流烘干器，郑州杜甫仪器厂;GENESYS 10S UV-VIS，Thermo Scientific。

1.3 方  法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制[9] 称取芦丁标准品0.010 0 g，用70%的乙醇在超声波下使其溶解，转移至100 mL容量瓶中定容，摇匀即得质量浓度为0.1 mg·mL-1的芦丁标准溶液，用移液管精密移取芦丁标准溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL比色管中，用70%乙醇补充各管体积至5 mL，各加入质量分数为10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，静止5 min，然后加入质量分数为 5%的NaNO2溶液0.3 mL，静止5 min，再加入质量分数为4%的 NaOH溶液3 mL，最后用70%乙醇定容至10 mL，摇匀，静止15 min，以空白溶液作为对照，于510 nm波长处分别测其吸光度（A），以吸光值为纵坐标Y，芦丁质量浓度为横坐标X，绘制标准曲线。

1.3.2 黄酮提取 超声辅助提取：称取5.000 g香椿样品粉末于圆底烧瓶中，超声辅助溶剂提取后抽滤除渣，滤液定容至500 mL容量瓶中，得黄酮提取液，待测。

微波预处理提取：称取5.000 g香椿样品粉末放入培养皿中，先经微波辐射预处理一段时间，再置于烧杯中恒温水浴提取60 min（料液比1∶40，温度60 ℃），抽滤除渣，得黄酮提取液，待测。

1.3.3 黄酮含量测定 采用1.3.1的方法测定黄酮提取液在510 nm的吸光度，然后按照下式计算香椿黄酮含量。

黄酮含量=（C×a×V）/w×100%

式中，C为提取液中黄酮浓度，mg·mL-1;a为稀释倍数，10;V为提取液体积，500 mL;w为样品粉末质量，5 g。

1.3.4 DPPH清除能力的测定[10] 取10 mL比色管，各加入2.0 mL不同浓度样品溶液，然后分别加入浓度为2×10-4 moI·L-1的DPPH溶液2.0 mL，混合摇匀，反应30 min后在517 nm处测定其吸光度A1。以2.0 mL无水乙醇代替DPPH的吸光度为A2，以2.0 mL的蒸馏水代替样品溶液的吸光度为A0，以无水乙醇作空白调零，同时以相同质量浓度的Vc作为阳性对照，平行测定3次。清除率计算公式如下：

清除率=（1-（A1-A2）/A0 ）×100%

式中，A0为对照组吸光值;A1为样液组吸光值;A2为空白组吸光值。

1.3.5 数据统计与分析 所有试验均设计3次重复，记录结果为平均值，采用OriginPro 8对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

如图1所示，以吸光值为纵坐标Y，芦丁质量浓度为横坐标X，制作标准曲线，并进行线性回归，得回归方程：Y=9.63X+0.013 3，线性相关系数R2=0.999 0，芦丁标准溶液在0.01～0.05 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2 不同提取方法比较

如图2和3所示，采用微波辐射预处理法和超声辅助提取法对红油香椿不同部位的黄酮类化合物进行提取，2种提取方法的香椿不同部位黄酮得率及DPPH自由基清除活性均相差不大，微波提取法略高于超声波提取法，且老叶>嫩芽，老茎>嫩茎。这主要是由于超声波法是通过空化作用产生剪切力破碎细胞，加速了香椿样品中有效成分溶出[11];而微波法是利用微波辐射产生高频电磁波，样品材料内分子互相碰撞挤压，使得细胞内有效成分从细胞壁周围自由流出。两者均是通过破坏细胞壁的组成和结构，来提高细胞通透性，加速胞内物质的溶出速度， 从而增加有效成分的提取率[12]。因此，在后续试验中，选择微波法来提取香椿中黄酮类化合物。

2.3 不同萃取溶剂比较

由图4和5可以看出，红油香椿黄酮类化合物在80%甲醇、70%乙醇、80%丙酮中的提取效果较好，得率与DPPH自由基清除率均较高，在80%丙酮中提取效果最好，其次是80%甲醇、70%乙醇。由于溶剂极性大小为：甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯>氯仿>石油醚，而黄酮类化合物具有一定的极性，但极性并不是很大。因此，香椿黄酮类化合物在80%丙酮中溶解度要高于其它提取溶剂。从香椿不同部位黄酮得率和清除DPPH自由基能力来看，老叶>嫩芽，老茎>嫩茎。综合考虑成本、安全性和同时高产率提取黄酮，故选择乙醇为最佳提取溶剂。

2.4 不同茬口比较

采用微波辅助乙醇提取法对不同茬口红油香椿黄酮类化合物进行提取，并测定黄酮含量及DPPH自由基清除率。由图6和7可以看出，头茬香椿的黄酮含量高于二茬香椿，且不同部位表现出如下趋势：老叶>嫩芽，老茎>嫩茎。由于黄酮为植物次生代谢产物，在香椿生长发育的特定阶段形成，其合成酶系因受到外界气候环境变化影响，最终会造成黄酮含量不同采收时间的变化[13]。DPPH自由基清除活性与黄酮含量结果大体保持一致，但有略微差异，这可能是由于不同部位的黄酮提取液含有其他较多杂质，彼此协同作用表现出区别于得率趋势的抗氧化活性。

2.5 不同栽培环境比较

如图8所示，不同栽培环境下头茬香椿不同部位黄酮含量差别很大，棚栽香椿黄酮含量显著低于露地栽培香椿的黄酮含量，这与罗旭璐等[14]对紫椿嫩叶的研究结果一致，露地栽培的黄酮含量大于大棚栽培的含量。这可能是黄酮类物质合成受到不同栽培环境下光照、温度、空气湿度、土壤等条件的影响，因而表现出比较明显的含量差异[15]。不同部位黄酮含量仍表现出如下趋势：老叶>嫩芽，老茎>嫩茎。同时，清除DPPH自由基能力与黄酮含量结果保持一致，两者呈正相关关系，如图9所示，这是因为黄酮类化合物含量与抗氧化活性密切相关，是重要的抗氧化活性成分。

3 结论与讨论

（1）采用微波辐射预处理法和超声辅助提取法对红油香椿不同部位的黄酮类化合物进行提取，比较分析黄酮得率及DPPH自由基清除率，表明微波法提取效果略优于超声波法。溶剂萃取方面，丙酮的提取效果最好，其次为甲醇、乙醇，但出于成本和安全性考虑，选择乙醇为最佳提取溶剂。

（2）以70%乙醇为提取溶剂，采用微波法对不同茬口与栽培环境下香椿不同部位的黄酮含量及DPPH自由基清除活性进行研究，表明头茬香椿优于二茬香椿，露地栽培优于大棚栽培。

（3）黄酮类物质是具有保健功能的天然产物，具有抗氧化、调节血糖、降血压、软化血管等多种生理活性。从香椿不同部位黄酮含量及DPPH自由基清除率方面来看，香椿嫩芽及嫩茎等幼嫩组织均不及香椿老叶及老茎部分，但香椿幼嫩组织营养丰富[16-17]，多用于鲜食。而香椿老叶及老茎等老化废弃组织由于木质化程度高，不可鲜食，为香椿产业主要副产物，但由于其富含黄酮类化合物，为以后研究开发利用黄酮类天然活性物质提供了良好的植物资源，同时为进一步研制开发香椿抗氧化功能性食品奠定了一定的理论基础。

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