基于SSR分子标记的广西德保县和隆林县野生古茶树聚类分析

彭靖茹 李朝昌 檀业维 温立香 张芬 叶靖平

摘要：【目的】对广西德保县和隆林县野生古茶树及其他省份名优栽培种茶树进行聚类分析，为野生古茶树种质资源保护、良种选育及创新利用提供理论参考。【方法】利用筛选出的15对SSR引物对9份广西德保县和隆林县的野生古茶树种质和15份名优栽培种茶树种质进行聚类分析，并计算遗传相似系数。【结果】筛选出的15对引物从德保04和德保05未扩增出任何条带，但从其余22份茶树样品中共扩增出183条谱带，其中CS1引物扩增出多态性谱带最多，为19条，最少为CS13引物，仅7条，平均每对引物扩增出多态谱带12.26条，多态率为96.17%。22份茶树种质资源可聚为两大类群，其中德保县和隆林县的野生古茶树聚在Ⅰ类群，栽培种茶树聚在Ⅱ类群。根据遗传相似系数，也可获得上述相同的分类结果。茶树品种间的遗传相似系数为0.48～0.84，平均遗传相似系数为0.67，其中，野生古茶树种质资源间的遗传相似系数为0.68～0.84;栽培种茶树间的遗传相似系数为0.62～0.84;野生古茶树与栽培种茶树的遗传相似系数为0.48～0.77。仅德保06与其他野生古茶树（隆林42和德保01）遗传相似系数小于0.70;栽培种茶树与野生古茶树相比，仅黄观音与野生古茶树（德保01和德保G02）遗传相似系数大于0.70。【结论】广西德保县和隆林县的野生古茶树种质起源相近，与我国其他各省份的名优栽培种茶树亲缘关系较远，存在相远近亲和相近远亲共存现象，进一步证实广西德保县野生古茶树为五柱茶系的厚轴茶，推测桂西北山区广泛分布山茶属原始种系。

关键词： 野生古茶树;SSR分子标记;聚类分析;遗传相似系数;广西

中图分类号： S571.102.4                      文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0001-07

0 引言

【研究意义】野生古茶树蕴藏各种优良性状的遗传基因，对茶树的分类、演化、变异、育种及生产等均具有较高的研究利用价值。广西适宜茶树生长，野生古茶树种质资源非常丰富，尤其以百色地区、十万大山和六万大山最丰富（陈亮和虞富莲，1996;诸葛天秋等，2016）。因此，收集广西野生古茶树种质资源并分析其遗传多样性，对其资源保护、新品种育种及开发利用均具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有较多有关广西野生古茶树种质资源的研究报道。左志明等（1994）对桂西山区的野生古茶树进行考察，结果发现，百色、隆林、那坡、德保等县（市）的野生古茶树多为乔木或小乔木树形，且果大皮厚，中轴粗大，种隔明显，为山茶属茶组植物早期分化的原始种系，具有较高的学术研究价值。赖兆荣等（2015）从广西崇左扶绥县姑辽收集野生古茶树种质资源，并利用其成功选育了多酚含量达特异资源指标且制茶品质较好的优异单株。刘彤等（2015）利用10条ISSR引物对柳州九万山的野生古茶树种质资源进行亲缘关系和遗传多样性研究，结果表明，其遗传多样性较丰富，但大部分单株亲缘关系较近。陈莹玉等（2016）采用RAPD分子标记分析广西金秀县4个地方的8个野生古茶树资源与其他省份茶树栽培品种的亲缘关系，结果表明，广西金秀县的野生古茶树资源具有原始特性，且遗传多样性较丰富。蓝燕等（2017）、韦柳花等（2017）对广西野生古茶树叶片解剖结构观察、适制性、化学成分、形态特征等进行研究，挖掘出一些优质或特异的野生古茶树种质资源。李朝昌和蒋漓生（2018a）对广西16个市（县）33个点的野生古茶树进行系统、全面地调查，共收集了150份野生古茶树资源，其内含物差异较明显，部分种质达到茶树优异种质资源标准。【本研究切入点】广西隆林县和德保县的野生古茶树资源主要分布于云贵高原的边缘地带，野生古茶树种质资源非常丰富，但该地地理位置偏僻，其野生古茶树资源未能充分开发利用。虽然蓝燕等（2017）、李朝昌和蒋漓生（2018a）对广西百色德保县和隆林县的野生古茶树资源进行收集、性状观察、生化分析等，但未见从DNA水平上开展其遗传多态性及亲缘关系研究的报道。【拟解决的关键问题】利用SSR分子标记对广西德保县和隆林县的野生古茶树种质资源和其他省份名优栽培种茶树进行聚类分析，并从DNA水平进行种质鉴别，为广西野生古茶树种质资源保护、良种选育及創新利用提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试茶树种质资源为广西百色市德保县东凌乡新屯村和隆林县德峨乡东南村的野生古茶树及广西亚热带作物研究所茶叶种质资源圃的名优栽培种茶树，具体信息见表1。主要试剂：HYQspinTM CT Plant DNA Kit试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;2×Taq™ PCR Master Mix和DNA Marker购自TaKaRa公司;30%丙烯酰胺（29∶1）购自北京索莱宝科技有限公司;硝酸银和其他试剂购自国药集团上海化学试剂有限公司。主要仪器设备：PCR扩增仪（ABI 9600，美国）、核酸蛋白质含量测定仪（BIO-RAD，美国）、DYY-6C电泳仪（北京六一仪器厂）和DYCZ-30C双板夹芯式垂直电泳槽（北京六一仪器厂）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品采集 分别采集茶树的新鲜叶片样品置于带干冰的保温箱进行保存及运输，在实验室加液氮研磨处理，并置于-80 ℃冰箱保存备用。

1. 2. 2 DNA提取 采用HYQspinTM CT Plant DNA Kit试剂盒提取茶树新鲜叶片DNA，并以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量、核酸蛋白质含量测定仪测定其纯度。

1. 2. 3 引物筛选及合成 参照姚明哲（2009）报道的40对SSR引物，从中筛选出15对在栽培种茶树多态性扩增效果较好的引物（表2），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1. 2. 4 PCR扩增及产物检测

PCR反应体系20.0 μL：2×PCR Mix 10.0 μL，30 μg/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL。PCR扩增在ABI9600基因扩增仪上进行。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 45 s，各引物退火温度（表2）退火45 s，72 ℃ 45 s，进行35个循环;72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取2.0 µL PCR产物在8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测（恒电压200 V，电泳时间60 min）。电泳结束后，非变性聚丙烯酰胺凝胶用硝酸银进行染色显影，具体方法：非变性聚丙烯酰胺凝胶先用ddH2O冲洗3次，每次洗1 min，然后置于0.5%～1.5%硝酸银中染色10～15 min，再用ddH2O冲洗3次，每次洗1 min，最后，在显影液中轻摇至显带清晰后放入ddH2O终止显影。

1. 3 统计分析

每对SSR引物检测到的各多态性条带均为一个等位基因。观察并统计扩增出的等位基因条带，将相同位置上有清晰条带赋值为“1”，无带时赋值为“0”，缺失时赋值为“9”，从而建立矩阵。利用NTSYSpc 2.10进行UPGMA聚类分析，并构建Neighbor-joining（NJ）系统发育进化树，计算Jaccard遗传相似系数。

2 结果与分析

2. 1 DNA提取及电泳检测结果

用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测24份茶树新鲜叶片DNA，上样量为2.0 μL，结果（图1）显示其DNA主带清晰，整齐无弥散，且点样孔无其他杂质。提取的茶树新鲜叶片DNA OD260/OD280为1.8～2.0。

2. 2 茶树种质资源SSR多态性分析结果

采用筛选出的15对SSR引物对24份茶树样品进行PCR扩增，结果发现，从野生古茶树种质德保04和德保05中未扩增出任何条带，其余22份茶树样品的扩增产物大小为20～500 bp，与预期结果相符。引物CS7和CS15扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2和图3所示。

由表3可知，15对SSR引物共扩增出183条谱带，其中CS1引物扩增出多态性谱带最多，为19条，最少为CS13引物，仅7条，平均每对引物扩增出多态谱带12.26条，多态率为96.17%。可见，SSR分子标记在茶树种质资源中具有较高的多态性，适用于茶树种质资源遗传多样性分析。

2. 3 聚类分析结果

由于筛选出的15对SSR引物从德保04和德保05未扩增出任何条带，因此，只能对其余22份茶树种质资源进行遗传相似系数计算和聚类分析，结果如图4和表4所示。22份茶树种质资源可聚为两大类群，其中德保县和隆林县的野生古茶树聚在Ⅰ类群，栽培种茶树聚在Ⅱ类群。根据遗传相似系数，也可获得上述相同的分类结果。22份茶树种质资源间的遗传相似系数为0.48～0.84，平均遗传相似系数为0.67，其中，野生古茶树种质资源间的遗传相似系数为0.68～0.84，以隆林01与隆林42的遗传相似系数最高，为0.84，说明二者的亲缘关系最近;其次是德保01与德保G02，为0.83;以德保06与德保01的遗传相似系数最低，为0.68，说明二者的亲缘关系最远;仅德保06种质与其他野生古茶树（隆林42和德保01）遗传相似系数小于0.70。栽培种茶树的遗传相似系数为0.62～0.84，其中黄观音与白叶一号的遗传相似系数最高，为0.84，表明二者的亲缘关系最近;其次是黄观音与黄金芽，为0.82，紫鹃与云大2的遗传相似系数最低，仅为0.62，表明二者的亲缘关系最远。野生古茶树与栽培种茶树的遗传相似系数为0.48～0.77，其中以德保G02与黄观音的遗传相似系数最高，为0.77，表明二者的亲缘关系最近;隆林06与福鼎大毫的遗传相似系数最低，为0.48，说明二者的亲缘关系最远。栽培种茶树与野生古茶树相比，仅黄观音、德保01和德保G02的遗传相似系数大于0.70，其余栽培种茶树与野生古茶树的遗传相似系数均小于0.7，表明野生古茶树与我国其他省份名优栽培种的遗传距离较远，可用于茶树远源杂交选育优良品种。

3 讨论

本研究的聚类分析结果显示，22份茶树种质资源可聚为两大类群，其中广西德保县和隆林县的野生古茶树聚在Ⅰ类群，栽培种茶树聚在Ⅱ类群，根据遗传相似系数，也可获得相同的分类结果，表明广西德保县和隆林县的野生古茶树种质进化起源相近。此外，在9份野生古茶树样品中，筛选出的15对引物从德保04和德保05未扩增出任何条带，致使这2份样品无法进行聚类分析及遗传相似性分析，说明这15对引物不适用于全部野生古茶树的遗传相关性分析，但非常适用于栽培种茶树的遗传相关性分析，间接证明野生古茶树与栽培种茶树间的遗传信息差异明显。综上所述，广西德保县和隆林县的野生古茶树种质起源相近，与栽培种茶树亲缘关系较远。

本研究供试野生古茶树来源于德保县东凌镇、隆林县德峨乡，两地相距较远（约300 km），但聚类分析结果显示，隆林县的隆林049先与德保县的德保01和德保G02聚为一小类，而不是与隆林县的其他野生古茶树先聚类，表明隆林049与其地理距离远的隆林县野生古茶树种质遗傳距离最小;遗传相似系数分析结果显示，德保的德保06与德保01遗传相似系数最小为0.68，表明德保06与其地理距离近的德保县野生古茶树遗传距离较远。综上所述，野生古茶树遗传距离与地理距离不是单纯的“远对远”、“近对近”对应关系，既存在地理距离近且遗传距离近（称“相近且近亲”）的同种聚集现象，也存在地理距离远且遗传距离近（称“相远且近亲”）的同种分散现象、地理距离近且遗传距离远（称“相近且远亲”）的异种共存现象等情况。因此，将德保县和隆林县野生古茶树同时存在的2种非对应情况简称为相远近亲和相近远亲共存现象。

厚轴茶是茶组植物较原始的种之一。广西德保县的野生古茶树子房3～5室，经鉴定是五柱茶系的厚轴茶（张宏达，1984年），其咖啡碱含量非常低，为0.34%（蓝燕等，2017），根据农业农村部标准NY/T 2031—2011《农作物优异种质资源评价规范 茶树》描述属于茶树特异种质资源，是选育低咖啡碱茶树的良好亲本材料。广西隆林县的野生古茶树为特大叶的乔木型茶树，子房5室，咖啡碱含量2.7%～3.0%，不属于低咖啡碱特异种质资源（李朝昌和蒋漓生，2018b），但是否属于厚轴茶种质资源，还需进一步对其果实、花、叶等方面进行观测研究。厚轴茶主要分布于云南的文山、红河及贵州等地区（张文驹等，2018），基本是按采集地进行区分，但各地厚轴茶种质资源间的差异鲜见报道，尤其是DNA水平间的遗传差异未见报道。由于桂西北山区与云南、贵州等厚轴茶分布地区相邻，地理距离相近、环境气候相似，且前人（张宏达，1984）已将广西德保县的野生古茶树鉴定为五柱茶系的厚轴茶，本研究也从DNA水平证实广西德保县和隆林县野生古茶树存在“相远近亲和相近远亲共存现象”。因此，推测桂西北山区广泛分布山茶属原始种系。

茶树种质资源的传统鉴别方法主要是根据新梢、定型叶、营养芽物候期、花、果实等性状进行判定。本研究采集的茶树栽培种主要引种于湖南、福建、云南、浙江等地选育的优良品种，在当地广泛种植。由于广西亚热带作物研究所茶叶种质资源圃位于南宁市，其气温相对较高，部分品种茶树的特殊性状发生明显变化，如白叶一号是浙江省选育出的优良品种，是制作安吉白茶的主要茶树品种，在当地早春由于嫩叶叶绿素缺失而呈玉白色，最白为一芽二叶时期（赖建红等，2016），但该品种引种至广西南宁市后，长达4年的种植期间均未发现白叶现象。可见，部分茶树品种在环境气候等相差较大的不同地区生长，其叶形、叶色等重要性状表现会发生改变。因此，采用传统鉴别方法，即根据茶树嫩芽、叶白化的重要性状表现作为依据，将无法正确做出判断。但通过分子标记技术可较准确鉴别是否同一品种及品种间的遗传差异，为茶树良种推广和提高茶树选育种效率提供技术保障。张羽等（2017）利用SCoT、EST-SSR和SRAP分子标记对湘波绿、金牡丹、金观音等50多种茶树种质资源进行亲缘关系研究，其中SCoT聚类分析结果显示，湘波绿与金牡丹亲缘关系较近，与本研究聚类分析结果相近。 由于不同的分子标记所揭示的基因组位点信息不同，因此，聚类分析结果也存在一定的差异。在品种鉴别时，应采用多种分子标记方法，结果更准确。本研究只使用了15对SSR引物开展研究，有2份样品尚未能有效完成其遗传多态性分析，因此，后续工作将继续筛选更多数量、合适的引物进行茶树分子标记研究。

4 结论

广西德保县和隆林县的野生古茶树种质起源相近，与我国其他各省的名优栽培种茶树亲缘关系较远，存在相远近亲和相近远亲共存现象，进一步证实广西德保县野生古茶树为五柱茶系的厚轴茶，推测桂西北山区可能有分布较广的山茶属原始种系。

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（責任编辑 陈 燕）