筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物的止血作用*

黄徐英，宋红萍，柳鑫，屠寒，陈玲

(武汉市第四医院、华中科技大学同济医学院附属普爱医院药学部，武汉 430034)

筒鞘蛇菰(BalanophorainvolucrataHo ok.f.)又名鹿仙草，为蛇菰科蛇菰属草本寄生植物[1]。筒鞘蛇菰是湖北省西北武当山、神农架林区具有地方特色的民间草药。其气味甘苦，无毒，具有凉血止血、镇痛和生肌作用。在民间常用于治疗各类出血症，功效奇佳[2-3]。前期研究发现，筒鞘蛇菰乙酸乙酯部位可显著缩短小鼠出血时间和凝血时间，为止血作用的主要活性部位[4]。因此，本实验以乙酸乙酯部位为研究对象，探讨其止血作用的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，鼠龄3个月，体质量160～200 g，动物质量合格证号：42000600025169，购自湖北省实验动物研究中心，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2017-0065。大鼠分笼饲养，自由摄食和饮水，饲养环境温度22～24 ℃，相对湿度为40%～60%。

1.2药品与试剂 筒鞘蛇菰(湖北天济中药饮片有限公司，批号：20161201)，经武汉市第四医院陈贵生主任中药师鉴定为蛇菰属植物筒鞘蛇菰；云南白药(云南白药集团股份有限公司，批号：ZCB1708)；石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、氯化钙、枸橼酸钠(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，纯化水。试剂盒：凝血酶时间(thrombin time,TT，批号：46951)、凝血酶原时间(prothrombin time,PT，批号：546986)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT，批号：557232A)，纤维蛋白原(fibrinogen,FIB，批号：547511)，均为Siemens公司生产。血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：AK0017JUL25002)；6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：AK0017JUL23001)。

1.3仪器 FW177中药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；98-1-B电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；HH-SH数显恒温水浴锅(常州莆田仪器制造公司)；ALC-210.2电子天平(北京塞多利斯天平有限公司，d=0.01 g)；DZF-6030真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；TGL-16台式高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司，r=62.2 mm)；CS-2000i全自动凝血分析仪(日本希森美康株式会社)；DR-200Bs酶标仪(无锡华卫德朗仪器有限公司)。

1.4方法

1.4.1样品溶液的制备 取筒鞘蛇菰粗粉(过孔径700 μm筛)，用95%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，趁热过滤，减压回收溶剂，得浓缩液，进一步水浴挥至无醇味，静置，冷却。加适量水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取3次，取乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，真空干燥(60 ℃)，粉碎成粉，即制成乙酸乙酯萃取物(计算平均得率为11.6%)。临用前，用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成适宜浓度的混悬液。

1.4.2大鼠血浆复钙时间(plasma recalcification time,PRT)的测定 取SPF级Wistar大鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组(灌胃给予0.5%CMC-Na溶液)、云南白药组(即阳性对照组，0．33 g·kg-1)、筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物(小、中、大剂量组：0.29，0.58和1.16 g·kg-1)，每天给药1次，连续5 d。于末次用药后1 h，颈动脉插管取血，加入装有3.8%枸橼酸钠溶液的离心管内抗凝(血液与3.8%枸橼酸钠之比为9：1)，以1500×g，离心10 min，分离血浆备用。

取试管加入血浆0.1 mL，放入37 ℃水浴中温育1 min，然后各加入0.28%氯化钙溶液0.1 mL。混匀后再放入37 ℃水浴中，同时开始计时。30 s后每隔10 s缓慢倾斜试管1次。记录自加Ca2+至纤维蛋白形成，液面不动所需时间，即为该供试品组大鼠PRT。

1.4.3大鼠TT、PT、APTT、FIB的测定 分别取“1.4.2”项中血浆。严格按各指标试剂盒的要求进行TT、PT、APTT、FIB 的测定。

1.4.4大鼠TXB2和6-keto-PGF1α测定 分别取“1.4.2”项中血浆。严格按试剂盒说明书步骤操作，采用酶联免疫法检测TXB2和6-keto-PGF1α。

2 结果

2.1对大鼠血浆PRT的影响 空白对照组、云南白药组和乙酸乙酯萃取物小、中、大剂量组PRT分别为(117.73±16.73)，(78.73±15.17)，(86.69±14.45)，(73.77±16.14)和(60.39±17.70)s。与空白对照组比较，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物小、中、大剂量组均可显著缩短大鼠血浆复钙时间，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

2.2对大鼠TT、PT、APTT、FIB的影响 与空白对照组比较，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物大、中剂量组大鼠TT、PT、APTT均缩短，大鼠FIB的含量均上升，差异有统计学意义(P<0.01)。筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物小剂量组大鼠TT、PT、APTT缩短，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，但FIB的含量变化不显著。结果见表1。

表1 5组大鼠TT、PT、APTT、FIB比较Tab.1 Comparison of TT，PT，APTT and FIB among five groups of rats

与空白对照组比较，*1P<0.05，*2P<0.01。
Compared with blank control group，*1P<0.05，*2P<0.01.

2.3对大鼠TXB2和6-keto-PGF1α的影响 与空白对照组比较，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物大、中、小剂量组大鼠体内TXB2均上升，6-keto-PGF1α的含量均下降，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，同时TXB2/6-keto-PGF1α比值增加，差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表2。

表2 5组大鼠TXB2和6-keto-PGF1α比较Tab.2 Comparison of TXB2 and 6-keto-PGF1α among five groups of rats

与空白对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05。
Compared with blank control group，*1P<0.01，*2P<0.05.

3 讨论

凝血过程是由一系列凝血因子参与的酶促反应。经典的凝血瀑布学说认为凝血由内源性途径、外源性途径和共同通路组成[5-6]。本实验考察了筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物对大鼠PRT以及凝血功能指标PT、TT、APTT、FIB 的影响，结果显示，乙酸乙酯萃取物可同时缩短大鼠PRT、PT、TT、APTT，增加大鼠FIB，有显著的止血作用，具有激活内源性、外源性凝血途径中的多种凝血因子，促进凝血酶原和凝血活酶生成、提高FIB的含量、加速纤维蛋白合成的作用。

血小板活化是血小板聚集的启动环节。在血小板聚集中有一对精巧的分子调节机制，即血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)和前列环素(epoprostenol,PGI2)。TXA2是目前已发现的强收缩血管物质与血小板聚集剂之一。PGI2则是较强的血小板聚集抑制剂，具有抑制血小板的粘附、聚集和释放反应，抑制血小板的促凝活性等作用[7]。

PGI2和TXA2之间的动态平衡是维持正常止血功能的基础。但是由于TXA2和PGI2的半衰期很短，一般将TXA2和PGI2稳定的代谢产物TXB2和6-keto-PGF1α作为判断其浓度的指标[8]。本实验结果显示，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物能提高大鼠TXB2和下调6-keto-PGF1α的含量，增加TXB2/6-keto-PGF1α比值。因此，筒鞘蛇菰乙酸乙酯萃取物可能是通过对TXB2及6-keto-PGF1α含量的影响，增强血小板的聚集功能，从而加速血小板内部促凝物的释放，加速凝血。

筒鞘蛇菰属凉血止血药，本实验药理研究仅停留在其有效部位的研究，未能系统地揭示具体活性成分与止血药理作用、机制之间的关系。大量文献分析总结发现，凉血止血药大部分含黄酮类成分。潘剑宇等[9]研究筒鞘蛇菰化学成分时，从筒鞘蛇菰乙酸乙酯提取部位分离得到7种黄酮化合物，因此推断乙酸乙酯部位止血有效成分可能与黄酮类化合物有关。为使其质量可控，保证临床疗效，还有待于对其黄酮类化合物进一步深入研究。