解郁育胞方对慢性应激大鼠着床窗期外周血Th17/Treg的影响*

耿会转，滕婧，刘凯，王敏，张平，卢文婷，周顺长，黎烈荣

(1.湖北中医药大学第一临床学院，武汉 430061；2.湖北省中医院妇产科，武汉 430061；3.华中科技大学实验动物中心，武汉 430030)

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级未孕SD雌性大鼠，8周龄，体质量(200±10)g，连续1周做阴道脱落细胞涂片观察，选择有正常动情周期者40只纳入实验；SPF级雄性健康性成熟SD大鼠20只，体质量(250±10)g，均由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2008-0005，动物合格证号：42000600004150。所有大鼠经无菌程序转入华中科技大学实验动物中心SPF级屏障系统动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2010-0057。动物实验环境维持相对湿度40%～60%，温度20～24 ℃，噪声<60 dB，自由饮用无菌水，进食灭菌全价营养颗粒饲料(湖北万千佳兴实验动物有限公司提供)。

1.2药物 解郁育胞方药物组成：白芍10 g(批号为610101)，当归10 g(批号为802101)，白术10 g(批号为710112)，茯苓10 g(批号为1402007)，熟地15 g(批号为609102)，山药 15 g(批号为711205)，酒萸肉10 g(批号为801109)，醋香附10 g(批号为701112)，玫瑰花10 g(批号为609015)。所有药物均为精选中药，执行标准：《中华人民共和国药典》2015年版，由湖北辰美有限公司提供。处方药材炮制合格后，经湖北省中医院中药制剂室按水提法制成200 mL，药物浓度0.5 g·mL-1，放入4 ℃冰箱保存。醋酸泼尼松片(天津力生制药公司，批号：1701205)每片5 mg，用200 mL双蒸水配置使用，药物浓度0.025 mg·mL-1。

1.3试剂 RORγ免疫组化试剂盒(Bioss公司，批号：Bs-3863R)，Foxp3免疫组化试剂盒(武汉三鹰生物技术有限公司，批号：22228-1-AP)，无水乙醇(国药集团，批号：10009218)，APC标记抗鼠白细胞介素(IL)-17(IL-17-APC)流式抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：22016-1-022)，APC标记鼠抗Foxp3(北京博奥森生物技术有限公司，批号：22013-1-102)，二甲苯(国药集团，批号：10023418)，苏木精(Sigma公司，批号：H9627)，中性树胶(国药集团，批号：10004160)等。

1.4仪器 流式细胞仪 (美国 Beckman Coulter)，病理切片机(德国Leica RM 2016轮转式切片机)，切片刀(日本羽毛R35一次性刀片)，载玻片及盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)显微镜(日本 奥林巴斯BX53型生物显微镜检)。

1.5方法

1.5.1建立模型 采用ENNIS等[9]所述方法制作慢性应激大鼠模型。接受应激处理的大鼠置于独立房间，连续接受14 d的不同的应激原刺激，包括行动受限(2 h)、噪音(75 dB，1 h)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、夹尾(1 min，每天3次)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、电击足底(电压50 mV，每隔50 s刺激1次，每次持续10 s，共30次)。每日抓阄随机选择2种刺激。刺激14 d后以出现倦怠懒动、进食兴趣降低及修饰行为(抓痒、抬举、舔足等)减少等明显生物学行为，提示造模成功。

1.5.2给药方法 参照《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表》(见陈奇主编《中药药理实验方法》1994年版)来折算大鼠每日用药量。按照临床有效剂量计算出大鼠每日解郁育胞方用药9 g·kg-1，转化为混悬药液18 mL·kg-1，即给药容积18 mL·kg-1。按照体质量分层随机法将大鼠4组：正常对照组，应激组，应激+泼尼松组，应激+解郁育胞方组，每组10只。除正常对照组外，其余3组大鼠建立慢性应激模型。于刺激第15天开始，应激+泼尼松组每天9：00给予泼尼松溶液灌胃，给药剂量为0.45 mg·kg-1，给药容积为18 mL·kg-1；正常对照组、应激组灌服等体积纯化水(18 mL·kg-1)；应激+解郁育胞方组给予解郁育胞方溶液剂量为9 g·kg-1，给药容积为18 mL·kg-1。4组大鼠分别于第28天16：00 按照雌：雄=2：1合笼，经阴道涂片确认妊娠后第4天停药，当日16：00 处死大鼠，釆用流式细胞技术检测着床窗外周血Thl7、Treg细胞比例及比值；同时采用免疫组化技术检测着床窗子宫内膜 RORγt、Foxp3的表达。

②免疫组织化学(SP法)检测各组大鼠着床窗子宫内膜 RORγt、Foxp3的表达：取血结束后处死大鼠，剖取并分离子宫，其中一侧置10%多聚甲醛中固定待检，子宫组织常规石蜡包埋、3 μm厚切片，常规脱蜡、水化，EDTA 组织抗原修复后，将配置好的修复液(0.01 mmol·L-1枸橼酸缓冲液，pH值6.0)置于烧杯中高火煮沸，再将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯中的耐高温塑料切片架上，液面要浸过切片组织，修复时间10～15 min，用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，用油性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗(FOXP3抗大鼠多克隆抗体1：10)，加完一抗后于4 ℃湿盒中孵育过夜(15 h)。PBS冲洗切片3次，每次3 min，吸水纸擦干切片后滴加HRP标记的山羊抗兔/小鼠二抗，室温或37 ℃孵育20 min。加显色剂：PBS冲洗切片4次，每次3 min，甩去PBS液，吸水纸擦干切片，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，时间要控制好，切勿显色过深，当觉得可以时用自来水冲洗切片终止显色。再经过复染、脱水、封片，奥林巴斯BX53型生物显微镜检拍照，采集图像，每张切片选取3张400倍照片做吸光度分析，IPP6.0版软件对免疫组化照片进行吸光度分析。

2 结果

2.1各组大鼠子宫内膜Foxp3和RORγt的检测结果 见表1及图1。可知，Foxp3主要表达于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆和部分基质血管内皮细胞的胞浆，部分间质细胞有弱着色，各组表达强弱不一。4组平均吸光度值分别为：0.028±0.005，0.014±0.007，0.056±0.008，0.025±0.007。与正常对照组比较，应激组Foxp3的表达显著降低(P<0.05)，说明慢性应激对大鼠着床期子宫内膜Foxp3表达有抑制作用。应激+泼尼松组Foxp3的表达与其余3组比较，均差异有统计学意义(P<0.05)，说明泼尼松在抑制免疫方面有较好的作用。应激+解郁育胞方组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

各组大鼠子宫内膜RORγt的表达见图2及表1。可知，RORγt表达主要位于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆，各组表达强弱不一。4组平均吸光度值分别为：0.026±0.007，0.032±0.005，0.028±0.005，0.029±0.003。与正常对照组比较，应激组着床窗期子宫内膜RORγt表达显著增加(P<0.05)，说明慢性应激对大鼠的子宫RORγt表达有增强作用。应激+解郁育胞方组与正常对照组、应激+泼尼松组比较均没有明显差异(P>0.05)。

表1 4组大鼠子宫内膜Foxp3、RORγt检测结果Tab.1 Determination results of Foxp3 and RORγt in the endometrium of four groups of rats

与正常对照组比较，*1P<0.05；与应激组比较，*2P<0.05。
Compared with normal control group，*1P<0.05;compared with stress group，*2P<0.05.

图1 4组大鼠子宫内膜Foxp3的表达Fig.1 Foxp3 expression in the endometrium of four groups of rats

图2 4组大鼠子宫内膜RORγt的表达Fig.2 RORγt expression in the endometrium of four groups of rats

2.2外周血Th17、Treg亚群比例及比值比较 见表2。正常对照组与应激组Th17亚群细胞比例有明显差异(P<0.05)；与应激组比较，其余3组Th17亚群细胞比例均明显降低(P<0.05)，应激+解郁育胞方组与正常对照组、应激+泼尼松组Th17亚群细胞比例无明显差异(P>0.05)。Treg亚群细胞比例比较：正常对照组与应激组有明显差异(P<0.05)；与应激组比较，其余3组Treg亚群亚群细胞比例均明显升高(P<0.05)，应激+解郁育胞方组与正常对照组、应激+泼尼松组Treg亚群细胞比例无明显差异(P>0.05)。Th17/Treg比值方面：正常对照组与应激+解郁育胞方组无明显差异(P>0.05)；与应激组比较，其余3组Th17/Treg比值均有明显差异(P<0.05)；与应激+泼尼松组比较，正常对照组、应激+解郁育胞方组Th17/Treg比值均有明显差异(P<0.05)。

表2 4组大鼠 Th17、Treg亚群比例及比值比较Tab.2 Comparison of the proportion and ratio of Th17 and Treg subgroups among four groups of rats

与正常对照组比较，*1P<0.05；与应激组比较，*2P<0.05。
Compared with normal control group，*1P<0.05;compared with stress group，*2P<0.05.

2.3相关性分析 Th17/Treg比值与RORγt表达呈正相关(r=0.608，P<0.05)，Th17/Treg比值和Foxp3的表达呈负相关(r=-0.389，P<0.05)。

3 讨论

醋酸泼尼松具有抗炎、抗过敏、免疫抑制作用，可减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻炎症的表现；抑制炎症细胞，包括巨噬细胞和白细胞在炎症部位的集聚，并抑制吞噬作用、溶酶体酶的释放以及炎症化学中介物的合成和释放，防止和减轻组织对炎症的反应，减轻炎症表现；防止或抑制细胞介导的免疫反应及延迟性的变态反应，减少T淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞的数目，降低免疫球蛋白与细胞表面受体的结合能力，并抑制IL的合成与释放，从而降低T淋巴细胞向淋巴母细胞转化，并减轻原发免疫反应的扩展。临床上常用醋酸泼尼松减轻母胎界面的炎症反应，在本研究中用作阳性对照药物。但妊娠期妇女使用泼尼松可增加胎盘功能不全、新生儿体质量减少或死胎的发生率，动物实验有致畸作用，应权衡利弊使用。

对于情志活动异常的心理应激反应所引起的神经、内分泌、免疫功能失调，调肝是治疗的基础方法。中医各脏均在心理应激调节中起着作用，但核心在于肝脏。心理应激的物质基础是NIM网络，而中医肝的疏泄是维持促进全身气血运行，调适脏腑对应激的反应，存在着一定的NIM网络调节机制。解郁育胞方是黎烈荣教授以《傅青主女科·嫉妒不孕》开郁种玉汤及《太平惠民和剂局方》逍遥散化裁，是课题组经临床和实验研究多年的验方，由当归、白芍、香附、玫瑰花、白术、茯苓等组成，禀疏肝养肝、健脾益精为大法。香附、玫瑰花专于理气，疏肝解郁为君药。香附气平而不寒，专属开郁散气、顺肝之性，助肝之用。凡情志抑郁，肝失疏泄条达，气不能正常入于三焦，以致气结为病者，香附为必用品。玫瑰花柔肝醒脾，流气和血，和而不猛，宣通郁滞，而绝无辛温刚燥之弊，是柔肝和血之佳品。当归、白芍为肝经要药，当归补血，其气轻而辛，为血中之气药，入肝经而行血，疏达肝之气血；白芍敛肝柔肝，补敛肝之阴血，如是一补一行，一动一静，既养肝体又助肝用。君臣相伍，疏肝养肝，改善由于高强度、长时间的应激造成的机体内环境紊乱及免疫失调。肝郁不能疏泄水谷且又克脾土，使脾运化水谷功能失调，水湿不能运化从而出现“渗泻中满之证”，导致“腰脐之气不利”，任带失调，胎孕不受。白术苦甘温，归脾胃经，茯苓健脾渗湿，二者相伍补土实脾，通达任带。熟地、山药、山萸肉取六味地黄丸中三补，益肾填精，共为佐使。肾主生殖，脾为气血运化之源，脾肾两虚，与现代医学免疫紊乱相似。诸药配合，解肝郁，养肝血，健脾气，填肾精，疏中有养，补中寓通，行气而不伤正，养精而不滞血，使气血调和，任通冲盛，胞宫受物而易于孕育。

本研究发现，慢性应激大鼠着床期外周血Th17/Treg升高，子宫内膜表达Foxp3降低，RORγt水平升高，采用解郁育胞方肝郁后Th17/Treg下降至接近正常水平，着床窗期子宫内膜Foxp3表达明显升高，RORγt表达下降。解郁育胞方提高慢性应激大鼠子宫内膜容受性的可能机制为通过疏肝健脾益肾，使肝肾开合有度，藏泻有衡，任通冲盛，胞宫得养；脾气健运，气血生化有源。肝之疏泄，脾肾调补，共同作用于胞宫，调节机体免疫系统，降低应激对机体的损伤，增加机体抗应激能力，使Th17/Treg失衡得到纠正，共同维护母胎界面的免疫水平。解郁育胞方是一个既能改善胚胎着床又没有胚胎毒性的中药复方制剂，本研究对于临床助孕技术的心理应激辅助治疗，从疏肝养肝的角度，改善子宫内膜容受性，提高对母胎界面的免疫保护作用，有利于胎儿在宫内生长发育而不被排斥，提高临床妊娠率，疗效与使用泼尼松无明显差异，却规避了致畸等副作用。