去甲斑蝥素对人真皮淋巴管内皮细胞体外三维培养淋巴管生成的影响及其机制

徐永良，孙平，李明秋，赵微

牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157000

研究报道，肿瘤扩散主要是通过肿瘤细胞通过淋巴管向淋巴结转移而实现的[1]。随着现代医疗卫生事业的不断发展，肿瘤血管生成抑制剂研究实现了由实验阶段向临床试验的转变，取得了一定的成果。尤其是特异性人真皮淋巴管内皮细胞标记物（HDLEC）被发现，将肿瘤与新生淋巴管研究又推向了一个新的阶段，该研究有望为抗肿瘤新生淋巴管治疗提供更多的可能性，推动肿瘤生物治疗新模式的发展[2]。当前，关于淋巴管生成过程及机制尚不明确。作为治疗肿瘤疾病的传统中药，去甲斑蝥素（NCTD）抗淋巴管生成作用机制需要进一步研究[3]。该次研究采用HDLEC三维培养对淋巴管生成过程进行模拟，探究其对淋巴管生成因子以及基因表达的影响，总结其抗淋巴管生成的分子机制，以期为肿瘤抗淋巴管生成治疗的实现提供可靠的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

研究所用HDLEC细胞购自通派(上海)生物科技有限公司；人纤维蛋白原购自深圳市卫武光明生物制品有限公司；兔抗人VEGF-C抗体由上海万疆生物技术有限公司提供，见表1。

表1 材料及试剂来源情况

1.2 纤维蛋白凝胶的制备及细胞培养

选择3 mg/mL人纤维蛋白原与50 U/mL人凝血酶，采用PBS进行溶解，纤维蛋白凝胶的制备在6孔培养板中进行，分别在其中按照先后顺序加入500 μL纤维蛋白原、100 μL内皮细胞培养液以及10 μL凝血酶溶液，凝固后，在37℃温度环境下，将上述放置于95%空气饱和湿度、5%CO2培养箱中进行培养，时间以30 min为宜，直至纤维蛋白原凝胶呈现为胶冻状。提取300 μL培养好的HDLEC悬液注入凝胶表面，在室温状态下静置1 h，然后在其中加入2 mL内皮细胞培养液，将培养箱环境设置为95%空气饱和湿度、5%CO2，温度以37℃为宜，进行培养，每2 d对培养液进行更换，采用倒置光显微镜对细胞生长情况以及体外淋巴管予以观察，并做好相应的记录。培养1周左右，将HDLEC随机分为NCTD组与空白对照组，其中NCTD组加入1/3IC50NCTD40nM，持续培养24 h，记录其形态变化情况。对HDLEC进行1周培养，然后随机分为NCTD组与空白对照组，24 h后对HDLEC体外模拟淋巴管生成情况予以免疫细胞化学检测、Westen blot以及qPCR测定。

1.3 qPCR检测

严格按照Trizol试剂盒说明进行检测，首先将细胞总RNA进行提取，在cDNA逆转录试剂盒指导作用下，完成第一链cDNA的合成，然后实施PCR扩增，并给予定量PCR 检测。 扩增反应条件如下：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃30 s，前后共进行40个循环。数据分析采用北京豫维科技有限公司提供的Verilog序列检测系统自带软件，所有检测样品均配备两份。样本mRNA相对表达量以及测定CT值内部参照选择GAPDH，基因表达量的计算采用比较循环阈值的方法。

1.4 Western blot试验

按照试剂盒说明实施操作，将细胞进行裂解，并将蛋白提取，放置于RIPA裂解缓冲液中，其中包含了1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、50 mM Tris以及150 mM氯化钠，对兔抗人VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3抗体实施免疫印迹试验。蛋白条带显示采用Licor Odyssey双色红外成像系统（北京恒安瑞丰科技有限公司）。在计算与GAPDH相对的荧光强度时采用的是Odyssey软件。VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达积分光密度采用Image Pro Plus软件予以确定。

1.5 免疫细胞化学染色

采用S-P法进行免疫细胞化学染色。首先于玻璃盖玻片上放置浸渍35 mm培养皿纤连蛋白，然后再盖玻片上接种HDLEC。将其随机分为NCTD组与空白对照组，作用时间为24 h，将盖玻片取出，按照1：1的比例对甲醇与丙酮溶液进行固定，在常温状态下自然风干，然后保存于-20℃冰箱环境中。按照S-P法的要求对细胞片实施免疫细胞化学染色，阳性判断标准：细胞质内呈现出棕黄色颗粒。采用Image Pro PLus对染色结果进行测定，记录积分光密度值。

1.6 统计方法

研究所有数据采用SPPSS 22.0统计学软件上进行，所有计数资料采用百分比（%）表示，组间差异比较采用χ2检验，计量资料用（±s）表示，组间差异性用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NCTD组与空白对照组淋巴管生成情况比较

空白对照组HDLEC细胞多以椭圆、圆形为主，NCTD组少部分为管状结构。细胞形态随着时间延长表现为离壁、浮起。采用显微镜随机选取5个视野进行观察，取值3次，结果显示NTCD组淋巴管生成个数较空白对照组少，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

表2 NCTD组与空白对照组淋巴管生成情况比较[（±s），个]

表2 NCTD组与空白对照组淋巴管生成情况比较[（±s），个]

组别淋巴管生成个数N C T D组空白对照组t值P值1 0.9 2±2.3 5 6 7.2 9±5.3 6 2 3.5 5 2<0.0 5

2.2 NCTD对淋巴管生成中 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达的影响

经过免疫细胞化学染色及Western blot试验，可以发现NCTD组三维培养淋巴管中的VEGF-C以及VEGF-D蛋白呈现出明显的下降趋势，且对VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表达呈现出降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 3。

表3 NCTD对淋巴管生成中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达的影响[（±s），%]

表3 NCTD对淋巴管生成中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表达的影响[（±s），%]

组别 V E G F-C V E G F-D V E G F R-3 N C T D组空白对照组t值P值2.4 3±0.1 2 7.4 5±0.1 4 8.4 9 3<0.0 5 1 6.0 9±1.2 4 2 7.2 1±1.2 6 1 0.2 7 5<0.0 5 0.9 6±0.0 1 3.4 2±0.0 3 6.4 3 2<0.0 5

3 讨论

研究显示，淋巴管生成在胚胎期淋巴系统发育及淋巴管再生中发挥这极为重要的作用[4-5]。通常，血管生成与淋巴管生成是同步进行的，当肿瘤中有血管生成，可以判断肿瘤中也或多或少含有淋巴管生成[6]。以往有学者在动物模型中证实了肿瘤淋巴管的生成，且发现NCTD能够对胆囊及膀胱肿瘤细胞VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表达产生抑制作用[7]。该次研究在完成构建HDLEC体外培养淋巴管生成模型及功能化表征的基础之上，进一步采用生化分析及荧光检测方法实时跟踪药物的活性效应。在体外培养的淋巴管体系加入模型抗肿瘤药物，进行24 h药物处理,参照传统的细胞培养考察淋巴管内皮细胞的增殖（与未处理的细胞比较）和活性情况及淋巴管生成的影响。利用Western blot试验、免疫化学细胞染色检测药物的代谢过程进行药物分析，探讨体内过程影响药物抑制淋巴管生成的机理，进而完成基于淋巴管生成的抗肿瘤药物评价，可以发现淋巴管状结构形成与HDLEC迁移、增殖等有着密不可分的联系。学者袁小建等人[8]在研究中发现NCTD对HDLEC的形态和细胞的增殖具有显著的抑制和直接杀伤作用，并能促进、诱导HDLEC凋亡，且0.001 25 mg/mL组越过刮除线细胞数达到（32.5±4.3）个，高于 0.005 mg/mL 组（56.3±5.2）个（P＜0.05），其作用随 NCTD浓度而加强 (P＜0.01)。从该次研究结果看，NCTD组淋巴管生成数量少于空白对照组[（10.92±2.35）个vs（67.29±5.36）个]，且随着时间延长 HDLEC 细胞呈现出浮起、固缩碎裂等，细胞出现凋亡、坏死现象，证实了NCTD对HDLEC三维培养体外模拟淋巴管生成的抑制作用，与此同时，NCTD还能够抑制已经形成的淋巴管状结构，并对其进行破坏，与以往学者研究结果一致。尽管当前NCTD在临床上已被广泛应用于抗肿瘤治疗，然而其在抗肿瘤淋巴管生成方面却鲜有报道[9]。该次研究构建了HDLEC体外模拟淋巴管生成模型，采用Wesren bolt qPCR等检测，结果显示NCTD能够对淋巴管生成期间的VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表达起到下调作用，考虑与NCTD对淋巴管内皮细胞增殖、迁移作用有关[10]。但NCTD能够对恶性肿瘤引起的淋巴管生成起到抑制作用还需要进一步试验验证。在今后研究中可着重探讨NCTD与VEGFR-3抗体在肿瘤淋巴管生成中是否存在协同作用，为肿瘤抗淋巴管治疗提供借鉴。

综上所述，NCTD能抑制 HDLEC的增殖、迁徙，并对其有直接杀伤作用和凋亡诱导作用，这可能是NCTD抗淋巴管生成作用的基础。