不同产地紫花地丁中秦皮乙素的含量测定及特征图谱研究

王笑，李圆圆，孙志强，吴明泽，高鹏，代龙

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.山东禹泽药康产业技术研究院有限公司，山东 德州 251200)

紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁ViolayedoensisMakino的干燥全草，主要用于抗菌消炎、清热解毒、凉血消肿[1-2]。现代药理实验研究表明，紫花地丁临床上可用于治疗血栓、呼吸系统疾病及艾滋病等，其主要化学成分为秦皮乙素，是香豆素类化合物，具有抗炎、抗菌、镇痛、抗氧化等作用[3]。紫花地丁药效多，临床应用广泛，而且分布广、资源丰富,是很有开发前景的一味中药。但目前市场上出现较多易混品，如犁头草、紫花堇菜等，与紫花地丁为同科同属植物，外观性状上难以区别[4-5]。紫花地丁药材及其混淆品的HPLC 指纹图谱[6]，以及高效液相色谱法测定紫花地丁中某一成分的研究已有报道。目前的指纹图谱分析未对主要成分峰进行归属，无法全面反应药材的内在质量，而且《中国药典》[7]中没有建立药材的含量控制指标。因此，本文对不同产地紫花地丁中秦皮乙素的含量进行研究，建立了紫花地丁药材特征图谱，为紫花地丁药材标准化种植及药材质量标准全面提升提供数据支撑。

1 仪器与材料

1.1 药材

紫花地丁ViolayedoensisMakino均采自不同产地，经济南市药检所宋希贵主任药师鉴定为紫花地丁，均为人工种植药材。药材主要来源于山东、河南、山西、安徽4个省份，见表1。

表1 紫花地丁药材来源信息

1.2 仪器与试剂

LC-2030高效液相色谱仪(日本岛津制作所)；Mettler Toledo XS105电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；KDM型可调控温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

色谱甲醇、色谱乙腈(Sigma-Alorich)；秦皮乙素(110741-201708)对照品(中国食品药品检定研究院)；东莨菪内酯(110768-200504)对照品(中国食品药品检定研究院)；木犀草素(111520-201605)对照品(中国食品药品检定研究院)，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 紫花地丁中秦皮乙素含量测定

2.1.1 紫花地丁供试品溶液的制备

取紫花地丁粗粉0.4 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加体积分数60%的甲醇50 mL，称定质量，加热回流处理30 min，放冷，再称定质量，以60%的甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取滤液，即得。

2.1.2 色谱条件

色谱柱：Kinetex OOD-C18(100 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液，梯度洗脱程序见表2。流速1 mL·min-1；检测波长350 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL。

表2 HPLC梯度洗脱程序表

2.1.3 对照品溶液的制备

精密称取秦皮乙素对照品17.07 mg、东莨菪内酯对照品11.27 mg、木犀草素对照品12.03 mg，分别置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，置于4 ℃冰箱保存。

2.1.4 方法学考察

(1)线性关系考察

取秦皮乙素对照品适量，精密称定17.07 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为贮备液(0.682 8 g·L-1)。精密量取贮备液1、2、3、4、5、6 mL，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别进样5 μL，测得峰面积，计算回归方程[8]。

(2)精密度实验

取秦皮乙素对照品溶液68.28 μg·mL-1，进样5 μL，连续进样6次，测得峰面积值。

(3)稳定性实验

取样品约0.4 g，精密称定，按2.1.1的制备方法，制备供试品溶液，分别测定在不同时间的峰面积。

(4)重复性实验

取样品0.4 g，取6份，精密称定，按2.1.1的制备方法，制备供试品溶液，测定。

(5)加样回收实验

取紫花地丁药材(已知秦皮乙素含量为7.22 mg·g-1)6份，每份约0.2 g，精密称定，分别精密加入秦皮乙素对照品的甲醇溶液各50 mL，按2.1.1的制备方法，制备供试品溶液，测定。

2.1.5 样品测定

取15个批次的紫花地丁药材粗粉各0.4 g，精密称定，按2.1.1项下方法制备样品溶液，测定秦皮乙素的含量，每个批次平行测定2份，计算其含量及相对标准偏差。

2.1.6 数据处理

实验数据采用x±δSD表示，用Graphpad软件进行分析，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。

2.2 紫花地丁药材特征图谱

2.2.1 方法学考察

(1)精密度实验：取同一批次紫花地丁供试品溶液，按给定色谱条件进行测定，连续进样6次，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对精密度实验的图谱进行分析，计算共有峰的相对保留时间与相对峰面积的相对标准偏差，考察仪器的精密度。

(2)重复性实验：按2.1.1项下方法分别制备6份供试品溶液，按给定色谱条件进行测定，同上法进行分析，考察实验方法重复性。

(3)稳定性实验：取同一批次供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h进行检测，同上法进行分析，考察样品的稳定性[9-10]。

2.2.2 建立紫花地丁药材特征图谱

依次测定15批紫花地丁药材供试品溶液，采用高效液相色谱仪记录20 min的色谱图，即得。根据15批次紫花地丁药材供试品测定结果所显示的峰个数、相对保留时间和相对峰面积等相关参数，进行分析比较，制定优化的特征图谱。

3 结果

3.1 含量测定结果

3.1.1 方法学考察结果

(1)线性关系 秦皮乙素的线性方程与回归系数分别为：Y=2 265 495.02X-87 370，r=0.999 8，结果表明秦皮乙素进样量在0.068 28～0.409 68 μg范围内线性关系良好。

(2)精密度 秦皮乙素的峰面积相对标准偏差为0.3%，表明仪器精密度良好。

(3)稳定性 不同时间点秦皮乙素含量的相对标准偏差为0.91%，表明本品溶液在12 h内稳定。

(4)重复性 不同样品中秦皮乙素含量的相对标准偏差为0.97%，表明本测定方法重复性良好。

(5)加样回收率 平均回收率为 99.18%，相对标准偏差为1.48%，表明本方法合理可靠。

3.1.2 样品中秦皮乙素含量测定

15批紫花地丁药材因产地不同，秦皮乙素含量有所不同，河南产地秦皮乙素含量普遍偏高，山东临沂市普遍偏低，安徽亳州市含量差异明显。各产地紫花地丁秦皮乙素含量见表3，不同产地间秦皮乙素含量的显著性差异见图1。

表3 不同产地紫花地丁药材中秦皮乙素含量

图1 不同产地间秦皮乙素含量的显著性差异Fig.1 Significant difference of aesculin content among different habitats

P<0.05表示有显著性差异；P<0.01表示有极显著性差异；山西与安徽没有显著性差异。

3.2 特征图谱方法学考察

3.2.1 精密度

运用“中药指纹图谱相似度评价系统”计算[5]，结果相似度均大于0.99，各共有峰的相对保留时间、相对峰面积的相对标准偏差均小于3%，表明仪器精密度良好(图2)。

图2 精密度实验图谱匹配结果Fig.2 Chromatogram matching results of precision test

3.2.2 重复性

结果相似度均大于0.97，所得的6个色谱图中各共有峰相对保留时间、相对峰面积的相对标准偏差均小于3%，表明该方法的重复性良好(图3)。

图3 重复性实验图谱匹配结果Fig.3 Chromatogram matching results of repeatability test

3.2.3 稳定性

结果相似度均大于0.96，所得的6个色谱图中各共有峰相对保留时间，相对峰面积的相对标准偏差均小于3%，表明供试品溶液在12 h的实验过程内保持稳定(图4)。

图4 稳定性实验图谱匹配结果Fig.4 Chromatogram matching results of stability test

3.2.4 测定15批次紫花地丁特征图谱及其相似度评价

实验测得15批次紫花地丁药材特征图谱，可分离出近6个色谱峰。与共有模式对照图谱比较，可以得到6个共有峰，作为特征图谱特征峰(图5、图6)，并指认3个色谱峰(图7)。以4号峰为S峰，1～6号共有色谱峰的相对保留时间分别为：0.42、0.56、0.74、1、1.15、1.33，相对峰面积分别为0.06、0.12、0.17、1、0.04、0.07。图6为15批次不同产地紫花地丁药材供试品的特征图谱，与生成的对照图谱比较，15批次相似度均大于0.9，表明不同批次间药材比较稳定；相似度见表4。

图5 紫花地丁药材对照特征图谱Fig.5 Controlled characteristic chromatogram of Violae Herba

图6 15批次不同产地紫花地丁药材特征图谱Fig.6 Characteristic chromatogram of 15 batches of Violae Herba from different habitats

a紫花地丁药材供试品; b东莨菪内酯对照品; c秦皮乙素对照品; d木犀草素对照品图7 对照品特征图谱Fig.7 Characteristic chromatogram of reference substances

样品相似度样品相似度10.98790.99920.986100.98630.987110.99940.997120.99950.999130.99860.999140.99770.999150.99880.999

4 讨论

紫花地丁中的秦皮乙素具有多种药理作用，因此本研究主要针对秦皮乙素成分的测定建立特征图谱。通过考察15批次不同产地紫花地丁HPLC特征图谱并运用“中药指纹图谱相似度评价系统”进行数据处理[12]，找出6个共有峰，计算了各批次紫花地丁药材特征图谱的相似度。本研究所建立的方法具有重复性好、特征性强、方法简便等特点, 能较好地区分药材质量，可以作为紫花地丁的品质鉴别、质量控制及资源综合利用的依据。