秦艽药材与饮片标准汤剂的质量传递性研究

吴明泽，刘国飞，王笑，李婷，王常瞵，高鹏，代龙*

(1.山东中医药大学药学院,山东 济南 250355;2.山东禹泽药康产业技术研究院有限公司，山东 德州 251200)

秦艽是我国重要的传统中药之一，具有祛风湿、清湿热、止痹痛、退虚热的作用，始载于《神农本草经》，列为中品[1]。秦艽(GentianamacrophyllaPall.)属于龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana(Tourn.) L.) 植物[2]。现代研究表明，秦艽主要含有环烯醚萜苷类、木脂素类、黄酮类、三萜类等化学成分，具有抗炎镇痛、保护肝脏、免疫抑制、降血压、保护脑组织、抗流感病毒、抗肿瘤等药理作用[3]。其中龙胆苦苷和马钱苷酸在药材中含量较高，2015版《中国药典》将这两个成分作为药材质量评价的指标成分。现代药理学研究结果显示，除龙胆苦苷、马钱苷酸之外，其他多种环烯醚萜类成分也具有良好的药理活性，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷以及6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷均对fMLP诱导产生的超氧化物的生成有抑制作用[4]。所以，本实验对马钱苷酸、龙胆苦苷进行含量测定，在指纹图谱中指认马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷5种成分，对秦艽药材及饮片进行质量控制。

2019年3月，《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求(征求意见稿)》[5]中提出了药材、饮片和对应实物标准的质控项目之间应具有较好的相关性。应以浸出物(出膏率)、含量测定、指纹图谱等指标，全面考察药材-饮片-中间体-对应实物的相关性，即质量传递性。

中药饮片标准汤剂是在中医理论指导下以临床实际应用为参考，使用现代中药提取方法并通过标准化工艺规程制备而成的单味中药饮片水煎液。标准汤剂可以标化以水为溶媒的新型用药形式，较大程度上解决了中药配方颗粒等新型用药形式与临床中药汤剂间存在质量和疗效差异的问题。在国家出台的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》中则明确要求有关中药配方颗粒的所有研究均应与标准汤剂进行对比研究[6-8]。秦艽饮片炮制方法为除杂、洗净、润透、切厚片、干燥，因此，本实验将药材与饮片炮制方法相结合，将药材干切至饮片状，按照标准汤剂煎煮，与饮片标准汤剂进行比较，为经典名方中药材、饮片的质量传递性提供了一定的研究基础。

本实验拟建立同时适合于秦艽药材、饮片标准汤剂的指纹图谱，并结合含量测定、出膏率，进行秦艽的药材、饮片质量传递性研究，为秦艽的质量控制以及中药配方颗粒和经典名方研究提供借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪(日本株式会社岛津制作所，含Labsolution色谱工作站))；XS105型1/10万电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；KQ-500DV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TDl-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KDM型可调控温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)。

1.2 试药

15批秦艽药材购自不同产地，详见表1，经济南市药品检验所主任药师宋希贵鉴定，为龙胆科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.的干燥根。经检验，均符合2015年版《中国药典》秦艽项下的各项规定。15批秦艽饮片为上述15批药材按照药典标准炮制所得[2]，均为实验室自制。对照品龙胆苦苷(批号 110770-201716，w≥97.6%)、马钱苷酸(批号111865-201704，w≥97.4%)、獐牙菜苦苷(批号110785-201404，w≥98.3%)购于中国食品药品检定研究院；獐牙菜苷(批号PN1125SA13，w≥98%)、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(批号P26M6S1，w≥98%)购于上海源叶生物技术有限公司；水为娃哈哈纯净水，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

表1 秦艽药材信息

2 方法与结果

2.1 秦艽药材、饮片标准汤剂的制备

依据《医疗机构中药煎药室管理规范》[9]及《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》[10]中相关规定，确定工艺：称取干切至饮片状的药材(无洗、润步骤，直接干切)、饮片各100 g，加7倍量水浸泡30 min，加热回流30 min，趁热200目滤布过滤；药渣再加6倍量水，加热回流20 min，趁热过滤，合并两次滤液，备用。按此法制备秦艽药材、饮片各15批标准汤剂[11]。

2.2 HPLC指纹图谱的研究

2.2.1 供试品溶液的制备

取药材、饮片各15批标准汤剂，取3 mL标准汤剂加甲醇定容至10 mL，5000 r/min离心5 min，取上清液，过0.22 μm的微孔滤膜，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备

取马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.399 3 mg/mL、0.104 1 mg/mL、0.251 0 mg/mL、0.477 6 mg/mL、0.236 2 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 色谱条件

Cosmosil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相乙腈(A)-0.1%醋酸(B)，梯度洗脱(0～60 min，3%～15%A)；柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；检测波长为254 nm。

2.2.4 精密度实验

取秦艽药材标准汤剂(S5)按2.2.1项下制备方法制备样品，按2.2.3项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以龙胆苦苷色谱峰为参照峰，计算得各共有峰的相对标准偏差小于等于3.0%、相对峰面积的相对标准偏差小于等于5.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性实验

取秦艽药材标准汤剂(S5)6份，按2.2.1项下制备方法平行制备6份样品，按2.2.3项下色谱条件测定，记录色谱图。以龙胆苦苷色谱峰为参照峰，计算得各共有峰的相对标准偏差小于等于3.0%、相对峰面积的相对标准偏差小于等于5.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性实验

取秦艽药材标准汤剂(S5)，按2.2.1项下制备方法制备样品，按2.2.3项下色谱条件分别在0、4、8、12、16、20、24 h时测定，记录色谱图，以龙胆苦苷色谱峰为参照峰，计算得各共有峰的相对标准偏差小于等于3.0%、相对峰面积的相对标准偏差小于等于5.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 供试品测定

取2.1项下制备的药材、饮片各15批标准汤剂(S1～S15)，按2.2.1项下制备方法制备样品，按2.2.3项下色谱条件进行测定。

2.3 指纹图谱质量传递性分析

2.3.1 指纹图谱的相似度评价及色谱峰归属

将15批秦艽药材、饮片的色谱图数据文件分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件，设参照图谱、峰匹配，采用平均数法生成指纹图谱与对照指纹图谱，见图1～3。图谱中共有5个共有峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，表2可见，药材、饮片的相对峰面积的相对标准偏差均大于20%，说明不同产地、不同批次药材质量参差不齐，含量相差较大。采用全谱峰自动匹配计算相似度，由表3可见，15批秦艽药材、饮片与各自生成的对照指纹图谱相似度分别为0.996～0.999，0.990～0.998，说明各产地不同批次药材物质群接近。秦艽药材、饮片的对照指纹图谱相似度为0.999，对药材、饮片中的物质群进行归属分析，15批药材、饮片中都含有5个共有峰，根据对照品可指认峰1～5为马钱苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷，说明炮制对药材的物质群不会造成太大改变。

1 马钱苷酸； 2 獐牙菜苦苷；3 6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷；4 龙胆苦苷；5 獐牙菜苷图1 对照品HPLC图Fig.1 High-performance liquid chromatography (HPLC) chart of reference substance

图2 15批秦艽药材、饮片的HPLC指纹图谱比较Fig.2 High-performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint spectra among 15 batches of Radix Gentianae Macrophyllae medicinal herbs and standard decoction of medicinal slices

图3 秦艽药材、饮片对照指纹图谱Fig.3 Referance fingerprint spectrum of Radix Gentianae Macrophyllae medicinal herbs and standard decoction of medicinal slices

峰号秦艽药材相对标准偏差相对峰面积秦艽饮片相对标准偏差相对峰面积10.6110.0890.6110.08820.8210.0590.8200.05930.8520.1010.8520.09941.0001.0001.0001.00051.0780.0211.0780.021

表3 15批秦艽药材、饮片指纹图谱与各自对照指纹图谱的相似度

2.4 出膏率及转移率

按2.1项下方法制备药材、饮片标准汤剂，测定各15批样品的出膏率，公式为：出膏率=m/M×100%，其中，m为烘干后样品质量，M为药材、饮片的取样量，结果见表4。15批药材、饮片出膏率平均值为20.43%、19.71%，相对标准偏差为9.0%、9.6%，出膏转移率平均值为96%，相对标准偏差为2.7%，均未出现离散数据(均不超过平均值±30%)。

2.5 马钱苷酸、龙胆苦苷转移率

按2015年版中国药典一部秦艽含量测定项[2]对15批药材及饮片进行测定，按转移率=w/W×100%进行计算，其中，w为饮片中马钱苷酸、龙胆苦苷的质量分数，W为药材中马钱苷酸、龙胆苦苷的质量分数，结果见表5。马钱苷酸、龙胆苦苷从药材到饮片的转移率平均值分别为80.98%、80.56%，相对标准偏差分别为3.2%、10%，均未出现离散数据(均不超过平均值±30%)。

表4 秦艽药材、饮片出膏率及其转移率

表5 秦艽药材、饮片有效成分转移率

3 讨论

本文参照国家药典委员会公布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》[10]和卫生部、国家中医药管理局共同下发的《医疗机构中药煎药室管理规范》[9]，选取 15 批质量合格的秦艽，将药材与饮片炮制方法相结合，将干切至饮片状的药材与饮片，以水为溶剂，进行规范化煎煮，制备的秦艽标准汤剂质量传递性更好，更加标准化。

本文针对指纹图谱方法进行了优化，通过全波长扫描确定254 nm下色谱图基线平稳、分离度良好、峰信息更多，并考察不同流动相0.1%磷酸、0.1%甲酸、0.1%醋酸，确定0.1%醋酸峰形更好；柱温会影响保留时间及分离度，所以考察了25、30、35 ℃的柱温，确认柱温为30 ℃时分离度更好，且保留时间适宜。由15批药材、饮片的指纹图谱的各共有峰的相对峰面积可以看出，相对标准偏差均大于20%，说明不同批次的成分含量一致性较差，这与不同产地、气候、土壤、采收时间、加工方式等都有关，所以购买药材尽量挑选道地产地、主产区或GAP基地，这也侧面反映出中药材的规范化种植任重道远。

利用HPLC指纹图谱、出膏率、含量测定，对药材、饮片进行质量传递性分析，是经典名方及中药配方颗粒所提倡的方法，这种整体控制的方法具有良好的科学性和合理性[12]。该方法的建立将为经典名方研究提供借鉴，后期将应用到药材-饮片-中间体-对应实物的相关性分析中。