腺苷A3受体活化对溃疡性结肠炎患者结肠黏膜5-羟色胺的影响

任天华 吕敏敏 安晓萌 肖 鹏 林燕生 司徒伟基

溃疡性结肠炎(UC)多见于中青年，主要症状为反复血便、腹泻、腹痛等，严重影响患者的生活质量且耗费大量医疗资源，其病因和发病机制目前尚不明确。既往研究结果显示，UC患者的结肠黏膜腺苷A3受体(A3AR)表达异常[1]，A3AR激活可显著减轻动物结肠炎性反应[2]，表明A3AR在结肠炎发病机制中可能发挥重要作用。A3AR表达于结肠黏膜和肠嗜铬细胞(EC细胞)[3-4]。已知EC合成和分泌5-羟色胺(5-HT)，而5-HT在UC发病中起重要作用[5-7]。体外细胞实验发现，A3AR可调控EC细胞释放5-HT[3]。A3AR能否调节UC患者结肠黏膜5-HT，目前尚不清楚。本研究旨在探讨A3AR激动剂1-[2-氯-6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-1-脱氧-N-甲基-β-D-呋喃尿酰胺(2-Cl-IB-MECA)对结肠黏膜5-HT的影响，以明确A3AR在UC发病中的作用及其机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 UC诊断标准参照欧洲克罗恩和结肠炎组织(ECCO)在2012年发布的UC共识[8]。选择2016年6月—2018年1月在香港大学深圳医院就诊并行结肠镜检查的患者，其中活动期UC患者18例(UC组)，健康体格检查者11名(对照组)。UC组男11例、女7例；年龄24～68岁，平均年龄为(45.3±12.0)岁；病程0.5～11年，平均病程为(4.5±3.1)年。本研究获香港大学深圳医院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 检测结肠黏膜TNF-α和IL-1β水平、5-HT含量 和释放量 经结肠镜检查获取UC组和对照组的结肠黏膜组织，将其置于37 ℃、体积分数为0.05的CO224孔组织培养板中，于1 000 μL含有10%FBS(美国Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1 640培养基中孵育。取部分UC组的结肠黏膜组织，在其培养基中加入2-Cl-IB-MECA(100 nmol/L, 英国Tocris公司)处理24 h(UC+2-Cl-IB-MECA组)，对照组和另一部分UC组的结肠黏膜组织仅以培养基孵育。收集培养液，离心获取上清液，应用ELISA试剂盒(美国RayBio公司)测定TNF-α和IL-1β水平，应用酶免疫测定试剂盒(美国ENZO公司)测定5-HT释放量；收集结肠黏膜组织，制备结肠黏膜组织匀浆，按照酶免疫测定试剂盒说明书步骤测定5-HT含量。

1.2.2 检测结肠黏膜中A3AR、5-HT和色氨酸羟化酶1(TPH1)的表达 采用免疫荧光法检测A3AR、5-HT和TPH1在结肠黏膜中的表达。将结肠黏膜组织固定在10%的中性甲醛溶液中过夜，常规制备石蜡组织切片。将石蜡切片经脱蜡和水化后，经pH值为6.8的枸橼酸钠溶液高压锅进行抗原热修复，置于室温下0.1 mol/L PBS溶液(含5%正常驴血清和0.3%Triton X-100)中孵育30 min，置于4 ℃孵育一抗(均购自美国Abcam公司)过夜，使用的一抗包括兔抗A3AR抗体(1∶200)、山羊抗人5-HT(1∶1 000)和兔抗人TPH1(1∶100)。将切片以PBS溶液洗3次后，于室温下用相应的二抗(均购自美国Jackson ImmunoResearch公司)避光孵育1 h，使用的二抗包括Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG(1∶200)、Alexa Fluor 594标记的驴抗山羊IgG(1∶200)和Alexa Fluor 594标记的驴抗兔IgG(1∶200)。再将切片以PBS溶液漂洗后，用包含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗荧光衰减试剂封片(美国Cell Signaling公司)，应用荧光显微镜(日本Nikon公司)进行图像采集。免疫荧光染色后A3AR显示绿色，5-HT和TPH1显示红色。

1.2.3 检测EC细胞数量 于荧光显微镜下观察5-HT的免疫反应性，5-HT免疫反应阳性细胞即EC细胞。于20倍目镜下观察EC细胞并计数，每张切片计数3个视野的EC细胞数量和隐窝数量，计算平均每个隐窝的EC细胞数(EC细胞数/隐窝数)。

1.2.4 检测结肠黏膜A3AR和TPH1的蛋白质表达水平 应用蛋白质提取试剂盒(中国索莱宝公司)提取结肠黏膜组织总蛋白质，采用二喹啉甲酸(BCA)法检测总蛋白质浓度。采用Western印迹法定量检测A3AR和TPH1的蛋白质表达水平，经SDS-PAGE分离蛋白质后，转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂奶粉于室温封闭1 h，置于4 ℃孵育一抗过夜，使用的一抗包括兔抗A3AR抗体(1∶200，美国Abcam公司)、兔抗Tubulin(1∶1 000，美国Cell Signaling公司)、兔抗TPH1(1∶200，美国Abcam公司)、兔抗GAPDH(1∶1 000，美国Cell Signaling公司)。用含有Tween-20的Tris缓冲盐(TBST)漂洗后于室温下用二抗，使用的二抗包括HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000，美国Cell Signaling公司)孵育1 h，应用ECL试剂检测蛋白质条带，应用Quantity One软件定量分析图像。A3AR相对分子质量为35 000，故选择相对分子质量为55 000的Tubulin作为内参照，A3AR蛋白质表达水平以A3AR Western印迹条带灰度值与Tubulin灰度值的比值表示；TPH1相对分子质量为51 000，故选择相对分子质量为36 000的GAPDH作为内参照，TPH1蛋白质表达水平以TPH1 Western印迹条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计学软件。

2 结 果

2.1 UC组和对照组结肠黏膜A3AR表达情况 免疫荧光染色显示，对照组和UC组结肠黏膜中均可见A3AR表达，UC组的荧光强度弱，提示结肠黏膜A3AR免疫反应性较对照组明显降低，见图1。UC组结肠黏膜A3AR蛋白质相对表达量为1.27±0.19，显著低于对照组的2.43±0.25(P<0.01)。

A 对照组 B UC组图1 结肠黏膜中A3AR表达(免疫荧光染色，×20)

2.2 各组结肠黏膜TNF-α和IL-1β水平 UC组和UC+2-Cl-IB-MECA组的TNF-α和IL-1β水平均显著高于对照组(P值均<0.01)，而UC+2-Cl-IB-MECA组的TNF-α和IL-1β水平均显著低于UC组(P值均<0.01)。见表1。

组别NTNF-αIL-1β对照5102.27±22.2585.46±8.43UC10415.56±78.30①206.62±37.33①UC+2-Cl-IB-MECA10290.32±50.01①②141.22±19.85①②

与对照组比较：①P<0.01；与UC组比较：②P<0.01

2.3 各组结肠黏膜EC细胞数和5-HT含量 UC组和UC+2-Cl-IB-MECA组的EC细胞数和5-HT含量均显著多于对照组(P值均<0.01)，而UC+2-Cl-IB-MECA组的EC细胞数和5-HT含量均显著少于UC组(P值均<0.01)。见图2、表2。

A 对照组 B UC组 C UC+2-Cl-IB-MECA组 图2 结肠黏膜中EC细胞 (免疫荧光染色，×20)

组别NEC细胞数(个)5-HT含量(ng/mg)对照110.46±0.1424.69±7.08UC181.30±0.34①88.63±27.39①UC+2-Cl-IB-MECA180.85±0.21①②52.74±7.87①②

与对照组比较：①P<0.01；与UC组比较：②P<0.01

2.4 各组结肠黏膜TPH1蛋白质表达情况 免疫荧光染色显示，UC组结肠黏膜中TPH1的免疫反应阳性细胞较对照组显著增多，UC+2-Cl-IB-MECA组TPH1的免疫反应阳性细胞减少，见图3。对照组、UC组、UC+2-Cl-IB-MECA组的结肠黏膜TPH1蛋白质相对表达量分别为0.20±0.03、0.79±0.15、0.49±0.04，UC组和UC+2-Cl-IB-MECA组的结肠黏膜TPH1蛋白质相对表达量均显著高于对照组(P值均<0.01)，UC+2-Cl-IB-MECA组的结肠黏膜TPH1蛋白质相对表达量显著低于UC组(P<0.01)。

A 对照组 B UC组 C UC+2-Cl-IB-MECA组图3 结肠黏膜中TPH1的免疫反应阳性细胞(免疫荧光染色，×20)

2.5 各组结肠黏膜5-HT释放量比较 对照组、UC组、UC+2-Cl-IB-MECA组的结肠黏膜5-HT释放量分别为(15.18±3.42)、(81.16±16.62)、(39.52±8.14) ng/(mL·mg)，UC组、UC+2-Cl-IB-MECA组的结肠黏膜5-HT释放量均显著高于对照组(P值均<0.01)，UC+2-Cl-IB-MECA组的结肠黏膜5-HT释放量显著低于UC组(P<0.01)。

3 讨 论

肠黏膜5-HT几乎全部由EC细胞合成和贮存，5-HT的合成由色氨酸经色氨酸羟化酶(限速酶)催化生成，EC细胞释放5-HT，作用于各种5-HT受体发挥其生物学作用[7,9]。UC患者的结肠黏膜EC细胞5-HT合成和释放发生异常改变[6,10]，针对肠黏膜5-HT系统的药理学或分子生物学手段能显著影响结肠炎的严重程度[7,11]，证实结肠黏膜5-HT系统在UC发病机制中具有重要作用[12]。

UC患者结肠黏膜A3AR表达异常[1]。动物实验发现，A3AR激活可显著减轻动物结肠炎性反应的程度[2]；体外细胞实验发现，A3AR激活可显著减轻人结肠上皮细胞系炎性反应的程度[13]，提示A3AR在UC的发病机制中可能发挥重要作用。Ⅱ期临床试验发现，A3AR激动剂用于治疗类风湿关节炎[14]和银屑病[15]具有较好的疗效和安全性，但尚缺乏A3AR激动剂治疗UC患者的临床试验。

体外细胞实验发现，A3AR能调节EC细胞5-HT释放[3]。A3AR是否通过调节肠黏膜5-HT在UC中发挥作用尚不清楚。本研究采用UC患者离体结肠黏膜组织培养模型，观察A3AR激动剂2-Cl-IB-MECA对结肠黏膜炎性反应的作用，结果发现UC+2-Cl-IB-MECA组的TNF-α和IL-1β水平均显著低于UC组，表明2-Cl-IB-MECA能有效地抑制炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生。有研究[16]结果表明，炎性细胞因子TNF-α和IL-1β在UC发病机制中起着重要作用，提示2-Cl-IB-MECA能通过抑制TNF-α和IL-1β的产生而减轻UC患者结肠黏膜炎性反应。

本研究结果显示，UC组的EC细胞数显著多于对照组，5-HT含量显著高于对照组，符合UC的特点，与以往研究[10]的结果一致。UC+2-Cl-IB-MECA组的结肠黏膜EC细胞数、5-HT含量、TPH1蛋白质水平均显著低于UC组，表明2-Cl-IB-MECA可明显减少结肠黏膜EC细胞数和降低5-HT水平，抑制TPH1的表达。动物实验结果表明，TPH1基因敲除小鼠的结肠炎性反应程度改善；给予5-HT前体恢复TPH1基因敲除小鼠体内的5-HT水平，结肠炎性反应程度严重恶化，提示降低5-HT水平可以减轻结肠炎性反应程度[7]。本研究中，2-Cl-IB-MECA可能通过抑制TPH1蛋白质表达而降低结肠5-HT水平，这可能是UC患者结肠黏膜炎性反应减轻的原因。

本研究结果显示，UC组结肠黏膜5-HT释放量显著高于对照组，表明UC患者结肠黏膜释放过多5-HT，这与以往研究[6]的结果一致；而UC+2-Cl-IB-MECA组结肠黏膜5-HT释放量显著低于UC组，表明2-Cl-IB-MECA能减少5-HT释放量。5-HT具有重要的免疫调节作用，可调节多种免疫细胞分泌炎性细胞因子[17]，5-HT本身就可引起和加重肠道炎性反应[9]。因此，2-Cl-IB-MECA可能通过减少5-HT的释放，从而减轻UC患者结肠黏膜炎性程度。

综上所述，A3AR激活可能通过抑制5-HT合成和释放而减轻UC患者结肠黏膜炎性反应，A3AR在UC发病机制中具有重要作用，为UC提供了治疗靶点。