基于T淋巴细胞的肿瘤免疫综合治疗

储以微

肿瘤治疗是全球性难题，近年来我国恶性肿瘤的发病率和死亡率持续升高，因传统治疗的疗效有限，亟待创新思路、开拓发展。免疫系统是机体抵御肿瘤的重要防线，也是维持自身稳态的关键，从免疫角度探寻肿瘤治疗新手段行之有效。肿瘤免疫治疗遵循免疫识别、免疫活化和免疫效应3个基本过程，T淋巴细胞是这一过程中的主要实施者，且有正性和负性两群T淋巴细胞同时存在于免疫系统，负性T淋巴细胞诱导免疫耐受致肿瘤发生，而正性T淋巴细胞激活免疫应答以清除肿瘤。为重塑免疫微环境，提升免疫治疗效果，在国家自然科学基金基础研究项目和上海市科学技术委员会应用研究项目的持续资助下，依托复旦大学生物治疗研究中心，围绕如何抑制负向免疫调控的负性T淋巴细胞——调节性T淋巴细胞(Treg)，增强实施免疫攻击的正性T淋巴细胞——效应性T淋巴细胞(Teff)，本项目研究组(图1)开展了系列临床前和临床研究，获得的主要学术成绩如下。

图1 肿瘤免疫治疗项目研究组成员

1 采用低剂量放射和化学治疗(简称放化疗)选择性抑制负性T淋巴细胞增殖和功能

围绕如何抑制负性T淋巴细胞功能，本项目研究组于2006年首次证实低剂量抗肿瘤放化疗致淋巴细胞减少，为重塑免疫微环境提供空间，促进Teff借“淋巴细胞自稳增生”机制发生活跃增殖，并获得记忆样表型。同时，选择性诱导Treg凋亡、打破肿瘤免疫耐受、逆转免疫抑制性微环境。主要表现如下：①经化学治疗(简称化疗)药物处理后，小鼠外周血、脾脏和淋巴结呈现典型的淋巴细胞减少和后续的活化增殖现象，淋巴细胞总数于化疗后第4天左右跌至最低点，并在之后1周左右恢复至正常水平；②低剂量全身放射线照射小鼠，同样能够引发小鼠淋巴细胞减少现象，即实验小鼠外周血、淋巴结和脾脏淋巴细胞数量在放射线照射后第4天左右跌至最低点，之后逐渐恢复；③较之其他T淋巴细胞亚群，CD4+CD25+叉头翼状螺旋转录因子(Fox)p3+Treg对放化疗的杀伤作用更为敏感；④化疗药物紫杉醇注射液(商品名为泰素)能够通过上调CD95的表达诱导Treg凋亡，并通过下调Foxp3表达阻断Treg的抑制功能；⑤化疗药物紫杉醇注射液还能降低CD122+CD8+记忆性T淋巴细胞亚群在T淋巴细胞中的比例；⑥化疗药物紫杉醇注射液对T淋巴细胞的增殖没有影响，但可以促进活化T淋巴细胞的存活；⑦放射线照射后第14和21天，小鼠淋巴结中具有记忆表型(CD44high和CD62Llow)的T淋巴细胞比例明显上调。因此，该研究颠覆化疗损害免疫系统的传统观点，为放化疗联合免疫治疗提供最佳“时间窗”的序贯方案。相关文献发表于临床免疫学、免疫治疗等专业期刊ClincalImmunology、JournalofImmunotherapy，单篇最高引用达74次，引用杂志包括NatureCommunications、Neuro-Oncology、CancerResearch、CellDeathandDifferentiation等权威期刊。相关内容还获邀在国际免疫学大会(2007年)、全国肿瘤生物治疗大会(2010年)和全国免疫学大会(2008年)上作口头报告。

2 自主研发快速树突状细胞培养技术并开展临床研究

围绕如何增强正性T淋巴细胞肿瘤识别，聚焦树突状细胞这一免疫系统抗原提呈功能最强的细胞，自主研发了快速树突状细胞培养法(FastDC)，有效将传统的7～9 d的培养时间缩短为3 d，已获国家发明专利授权(专利号为ZL201310610764.8)，并成功实现成果转让(2016070601324800)。同时，利用CD133或A2B5筛选肿瘤干细胞，并制备相应的肿瘤抗原负载树突状细胞，在小鼠荷瘤模型中获得显著疗效。同时，通过分离患者外周血单核细胞体外诱导不成熟的树突状细胞，利用该患者肿瘤干细胞裂解液诱导成熟的树突状细胞疫苗，回输至患者体内，实现个体化治疗。相关Ⅰ期临床研究共入组5例复发脑胶质瘤患者，予以树突状细胞疫苗皮下注射(每周1次，共3次)，临床观察患者无明显不良反应，中位生存期达17.5个月，提示该疫苗患者的耐受性好，安全性高(结果发表于2011年的《中华神经外科杂志》)。随后，本项目研究组进一步开展了Ⅱ期临床研究(NCT01567202，2011临审第006号)以检验其有效性，历时3年余(2012年12月1日—2016年1月20日)，入组43例新发或复发脑胶质瘤患者，同样予以树突状细胞疫苗皮下注射(每周1次，共3次)。结果显示，该树突状细胞疫苗将异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)基因野生型端粒逆转录酶(TERT)突变型(IDH1WTTERTMU)患者的无进展生存期延长了2.5个月(7比4.5个月)，总生存期延长了6.5个月(14比7.5个月)，同时伴随辅助性T淋巴细胞(Th)1型细胞因子显著增多，T淋巴细胞肿瘤局部的浸润亦增多(结果发表于2018年CancerImmunology,Immunotherapy杂志)。

3 利用新型免疫佐剂Toll样受体(TLRs)增强正性T淋巴细胞肿瘤杀伤能力

围绕如何增强正性T淋巴细胞肿瘤识别和杀伤效应，聚焦TLRs。早期在果蝇研究中发现，TLRs主要在固有免疫系统中发挥作用，而近期在哺乳类动物的研究中发现TLRs同样可以表达于适应性免疫细胞(如T、B淋巴细胞)表面，且其表达程度与特异性免疫应答强度密切相关。然而，TLRs直接作用在T淋巴细胞上发挥作用的机制，特别是在如肿瘤等病理条件下TLRs如何影响T淋巴细胞的活化、分化和免疫应答类型及其机制等尚待阐明。因此，本项目研究组基于小鼠荷瘤模型开展系列工作，证实了TLR1/2和TLR4激动剂的抗肿瘤效应及其机制。研究结果表明，全身给予TLR1/2或TLR4激动剂治疗均可有效激发机体产生增强的抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤的发生、发展，延长荷瘤小鼠的生存时间，并能诱导长时程的免疫保护效应。在此基础上，本项目研究组还对两种激动剂的作用剂量、作用时间和作用方式进行了探索和优化，寻找最佳的抗肿瘤治疗策略。TLR1/2激动剂抗肿瘤的作用机制是通过直接作用于适应性T淋巴细胞表面的TLR2受体，显著下调Treg的免疫抑制功能，进而增强杀伤性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤的能力。而TLR4激动剂抗肿瘤的作用机制是通过TLR4受体直接促进CTL的杀伤功能，上调树突状细胞抗原提呈能力间接促进Teff的杀伤能力。首次证实了新型免疫佐剂TLRs通过多种机制增强正性T淋巴细胞的肿瘤杀伤能力，为其应用于临床肿瘤治疗提供依据，也为肿瘤免疫治疗提供新策略。相关文章发表于免疫学专业期刊JournalofImmunology和ClinicalImmunology，单篇最高引用61次，引用期刊包括CancerImmunologyResearch、ClinicalCancerResearch、JournalofHepatology和Leukemia等权威期刊。鉴于该研究的新颖性和实用性，一经发表即被权威学术机构Faculty of 1000和Global Medical Discovery推荐。

4 自主研发针对实体瘤的新型双特异性T淋巴细胞衔接子(BiTEs)淋巴细胞疗法

围绕如何增强正性T淋巴细胞肿瘤识别和杀伤功能，针对现有基于T淋巴细胞的免疫治疗用于实体肿瘤疗效欠佳的问题，自主研发了针对实体瘤的新型BiTEs淋巴细胞疗法。基于T淋巴细胞的免疫疗法主要包括嵌合抗原受体修饰T淋巴细胞(chimeric antigen receptor-T，CAR-T)治疗和BiTEs淋巴细胞疗法，两种疗法均已在非实体肿瘤中获得显著疗效，并获批上市，但其对实体肿瘤均未见显著临床疗效。因此，本项目研究组针对实体肿瘤，创新性地制备了由BiTEs修饰T淋巴细胞的新型CAR-T样细胞治疗技术。该技术利用BiTEs修饰T淋巴细胞，使其可持续性产生并分泌BiTEs，克服了传统BiTEs半衰期短、不可自我复制性、T淋巴细胞依赖，以及临床应用需多次反复注射、成本高和毒副反应强等弊端。而分泌的BiTEs可同时作用于基因修饰T淋巴细胞和其他非基因修饰T淋巴细胞，使两者均产生肿瘤特异性杀伤活性，分别发挥类似传统CAR-T和传统BiTEs的肿瘤特异性杀伤作用。此外，分泌的BiTEs还可直接作用于肿瘤细胞抑制其增殖，发挥类似抗体药物的作用，可谓“一箭三雕”，高效杀伤肿瘤。已在小鼠体内证实了新型CAR-T样细胞治疗技术的安全性和显著的抗肿瘤效果，相关内容获邀在国际免疫学大会(2016年)、全国免疫学大会(2015、2017年)上作口头报告。现该技术已获国家发明专利授权(ZL201510158263.X)，并已通过临床研究伦理审查(2015临审第253号)。鉴于该研究的新颖性和原创性，一经发表即被多家媒体、公众号报道和推送，并被多本专业期刊引用，如JournalofHematology&Oncology杂志评价该研究“为HER2阳性实体肿瘤治疗提供了新策略”，这也充分说明了本项目研究组的工作具有重要意义。

综上所述，本项目历时12年(2006—2017年)，聚焦T淋巴细胞抗肿瘤效应，发现了2种免疫治疗新机制，研发了2项免疫治疗新技术，开展了3项基于T淋巴细胞治疗的临床研究，并提供了4种临床有效的抗肿瘤免疫治疗手段。本项目改变了传统肿瘤治疗理念，为提升临床疗效提供综合性策略和方案。