缺氧-复氧对H9c2心肌细胞自噬和线粒体缝隙连接蛋白43的影响及其相互作用

李兆康 卢 青 丁世芳

目前，心肌缺血-再灌注损伤的机制仍未被完全阐明。自噬在缺血-再灌注过程中被上调，早期可能通过减少能量消耗和清除受损细胞器来保护心肌，而后期过度激活则对心肌有害，关于自噬在缺血-再灌注中的作用仍存在争议[1]。缝隙连接蛋白43(Cx43)是心室肌中含量最高的缝隙连接蛋白，除了在细胞膜上，它还定位在线粒体内膜上。线粒体Cx43参与线粒体呼吸链的调节，维持线粒体的稳定；此外，其在缺血预处理和后处理对缺血-再灌注心肌的保护中起关键作用，但关于线粒体Cx43本身在缺血-再灌注中的变化和作用却鲜见报道[2-3]。本研究通过建立H9c2细胞缺氧-复氧(H/R)模型，模拟心肌的缺血-再灌注过程，试图探究自噬和线粒体Cx43 在这个过程中的变化和相互作用关系，以期为临床防治缺血-再灌注损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠心肌细胞系H9c2(2-1)购自中国科学院上海细胞库。FBS、高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基均购自美国Gibco公司，格尔德霉素(GA)购自APExBIO公司，3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自美国Sigma公司；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、细胞线粒体分离试剂盒、细胞计数试剂盒(CCK-8)购自上海碧云天生物技术有限公司，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔多克隆抗体GAPDH购自杭州贤至生物有限公司，兔多克隆抗体Beclin-1、兔多克隆抗体coxⅣ均购自武汉三鹰生物技术有限公司，兔多克隆抗体LC3A/B购自美国Affinity品牌，兔多克隆抗体Cx43、兔多克隆抗磷酸化Cx43(p-Cx43)抗体均购自美国Cell Signaling公司，羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H9c2细胞培养 用含10%血清和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基(完全培养基)在37 ℃，二氧化碳(CO2)、氧气体积分数分别为0.05、0.21的培养箱中对H9c2细胞进行培养。待细胞密度达80%以上，用0.25%胰酶消化传代，24 h后换液，48～72 h后再进行传代。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞H/R模型建立 用不含血清的低糖DMEM培养基替换原有的完全培养基，将H9c2细胞置于37 ℃，CO2、氧气体积分数分别为0.05、0.21的缺氧培养箱中缺氧处理12 h后，将培养基重新更换为完全培养基并置于37 ℃，CO2、氧气体积分数分别为0.05、0.21的培养箱中复氧处理12 h。

1.2.3 分组 将H9c2细胞分为5组：对照组正常培养；另4组为处理组，分别为H/R组细胞按1.2.2方法进行H/R处理。GA组用含GA(1 μmol/L)的完全培养基在37 ℃，CO2、氧气体积分数分别为0.05、0.21的培养箱中预处理30 min，再按1.2.2方法进行H/R处理；3-MA组用含3-MA(5 mmol/L)的不含血清的低糖DMEM培养基缺氧处理12 h，再用含3-MA(5 mmol/L)的完全培养基复氧处理12 h；GA+3-MA组用含GA(1 μmol/L)的完全培养基在37 ℃，CO2、氧气体积分数分别为0.05、0.21的培养箱中预处理30 min，接着用含3-MA(5 mmol/L)的不含血清的低糖DMEM培养基缺氧处理12 h，再用含3-MA(5 mmol/L)的完全培养基复氧处理12 h。

1.2.4 LDH活性检测 将H9c2细胞按1×104/孔的密度接种于96孔板上，对照组和H/R组各8个复孔，收集每孔的培养液，按照LDH试剂盒说明书检测两组LDH活性。

1.2.5 CCK-8检测细胞活力 将5组H9c2细胞按1×104/孔的密度接种于96孔板上，每组8个复孔。另设空白组，只加培养液不加细胞。每孔加入10 μL CCK-8溶液(起始培养基为100 μL)，在37 ℃、CO2体积分数为0.05的培养箱中孵育1 h。孵育结束后用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度(A450)。将对照组细胞活力定义为100%，处理组细胞活力(%)=(处理组-空白组)/(对照组-空白组)×100%。

1.2.6 JC-1法检测线粒体膜电位 将H9c2细胞按(2～5)×105/孔的密度接种于6孔板上，每组3个复孔。用0.25%胰酶消化、离心后加完全培养基重悬。加0.5 mL JC-1染色工作液在37 ℃，CO2、氧气体积分数分别为0.05、0.21的培养箱中孵育20 min。孵育结束后130×g、4 ℃离心3 min，弃上清液。用JC-1染色缓冲液重悬细胞，在130×g、4 ℃离心3 min，弃上清液，该步骤重复2次后加500 μL JC-1染色缓冲液重悬，应用流式细胞仪分析。线粒体膜电位高时JC-1聚合物呈红色荧光，线粒体膜电位低时JC-1单体呈绿色荧光，以绿色荧光百分比(线粒体膜电位降低细胞百分比)表示线粒体膜电位的下降程度。

1.2.7 Western印迹法检测蛋白质水平 提取各组心肌细胞的总蛋白质，利用细胞线粒体分离试剂盒提取各组细胞中的线粒体蛋白质，采用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白质定量检测。每孔40 μg蛋白质样品经SDS-PAGE分离后，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂奶粉的TBST(Tris-HCl和吐温-20)缓冲液室温封闭2 h后(磷酸化蛋白质用1%～3%的牛血清白蛋白封闭)，分别放入抗coxⅣ一抗(1∶5 000)、抗GAPDH、Cx43和p-Cx43一抗(1∶1 000)、抗Beclin-1和LC3B一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜5～6次，每次5 min，加入HRP标记二抗(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h。TBST缓冲液洗膜5～6次，每次5 min，ECL显影，采集图像。Beclin-1、LC3BⅠ和LC3BⅡ以GAPDH为内参，线粒体Cx43和p-Cx43以coxⅣ为内参，用目的蛋白质灰度/内参灰度表示蛋白质相对表达量。

1.2.8 电子显微镜(简称电镜)观察自噬体 将H9c2细胞按(2～5)×105/孔的密度接种于6孔板上，每组2个复孔。吸除原培养液，加入2.5%戊二醛固定2 h后用细胞刮刮下细胞，320×g、离心5 min，2.5%戊二醛重悬，透射电镜观察自噬体。

2 结 果

2.1 H9c2心肌细胞H/R模型的建立 倒置显微镜观察细胞形态学变化，发现与对照组相比，H/R组漂浮的死细胞较多、细胞密度降低，见图1。H/R组的细胞活力为(85.14±9.01)%，显著低于对照组的(100.00±0)%(P<0.01)。H/R 组胞培养液中LDH水平为(163.20±7.26) U/L，显著高于对照组的(130.25±24.31) U/L(P<0.01)。H9c2细胞H/R模型成功建立。

2.2 各组自噬体及其相关蛋白质水平的比较 与对照组相比，H/R组的自噬体明显增多，内含被吞噬的线粒体等结构；GA组、3-MA组、GA+3-MA组的自噬体均较H/R组明显减少，其中GA组可见大量肿胀的线粒体， GA+3-MA 组细胞器损伤严重、结构模糊，见图2。 经Western印迹法检测，H/R组自噬相关蛋白质Beclin-1水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ均显著高于对照组(P值均<0.05)，GA组、3-MA组、GA+3-MA组的Beclin-1蛋白质水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ均显著低于H/R组(P值均<0.05)，GA+3-MA组的Beclin-1蛋白质水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ分别显著低于GA组和3-MA组(P值均<0.05)，见图3、表1。

A 对照组 B H/R组图1 对照组和H/R组H9c2心肌细胞的形态学变化(×100)

A 对照组 B H/R组 C GA组 D 3-MA组 E GA+3-MA组图2 透射电镜下观察各组细胞内的自噬体(×5 000)

1 对照组 2 H/R组 3 GA组 4 3-MA组 5 GA+3-MA组图3 Western印迹法检测各组H9c2心肌细胞中 Beclin-1和LC3B蛋白质表达结果

2.3 各组线粒体膜电位的比较 图4中右下象限代表绿色荧光所占百分比，比较各组线粒体膜电位下降程度发现，H/R组和对照组的线粒体膜电位分别下降(14.45±0.84)%和(7.34±0.75)%，H/R组的线粒体膜电位显著低于对照组(P<0.05)；GA组、3-MA组和GA+3-MA组的线粒体膜电位分别下降(27.87±1.68)%、(22.76±1.55)%和(38.88±1.41)%，其线粒体膜电位均显著低于H/R组(P值均<0.05)；GA+3-MA组的线粒体膜电位显著低于GA组和3-MA组(P值均<0.05)。

组别Beclin-1LC3BⅡ/LC3BⅠ对照0.26±0.030.77±0.09H/R0.89±0.05①4.37±0.50①GA0.75±0.06②③3.29±0.18②③3-MA0.47±0.03②③1.37±0.09②③GA+3-MA0.31±0.02②0.85±0.14②

与对照组比较：①P<0.05；与H/R组比较：②P<0.05；与GA+3-MA组比较：③P<0.05

A 对照组 B H/R组 C GA组 D 3-MA组 E GA+3-MA组图4 各组H9c2心肌细胞中线粒体膜电位的流式细胞术检测结果

2.4 各组线粒体Cx43蛋白质水平的比较 H/R组的线粒体Cx43和p-Cx43蛋白质水平均显著低于对照组(P值均<0.05)，GA组、GA+3-MA组的线粒体Cx43蛋白质水平均显著低于H/R组(P值均<0.05)，GA组、3-MA组、GA+3-MA组的线粒体p-Cx43蛋白质水平均显著低于H/R组(P值均<0.05)；GA+3-MA组的线粒体p-Cx43蛋白质水平分别显著低于GA组和3-MA组(P值均<0.05)，见图5、表2。

1 对照组 2 H/R组 3 GA组 4 3-MA组 5 GA+3-MA组图5 Western印迹法检测各组H9c2心肌细胞中线粒体Cx43和p-Cx43蛋白质表达结果

组别Cx43p-Cx43对照0.86±0.020.58±0.01H/R0.75±0.03①0.41±0.03①GA0.62±0.09②0.27±0.06②③3-MA0.72±0.040.33±0.05②③GA+3-MA0.59±0.07②0.18±0.04②

与对照组比较：①P<0.05；与H/R组比较：②P<0.05；与GA+3-MA组比较：③P<0.05

2.5 各组细胞活力的比较 H/R组的细胞活力为(91.94±4.77)%，显著低于对照组的(100.00±0)%(P<0.05)；GA组[(79.16±7.96)%]、3-MA组[(49.66±10.65)%]、GA+3-MA组[(40.45±3.59)%]的细胞活力均显著低于H/R组(P值均<0.05)；GA+3-MA组的细胞活力分别显著低于GA组和3-MA组(P值均<0.05)。

3 讨 论

本研究中H9c2细胞在经历H/R后，细胞死亡增多、密度降低，细胞活力下降，LDH水平上升，表明H9c2心肌细胞H/R模型建立成功。

Beclin-1是再灌注阶段调控自噬活动的关键因子，LC3B参与自噬体的延伸，LC3B Ⅰ转变成LC3B Ⅱ并定位在自噬体膜上是自噬体形成的标志，检测Beclin-1蛋白质表达水平和LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ值可反映自噬水平。本研究进一步经电镜观察自噬体的结果显示，与对照组相比，H/R组Beclin-1水平和LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ均升高，电镜下见H/R组自噬体增多，表明H/R引起心肌细胞自噬活动增加，这与既往报道一致。与H/R组相比，3-MA组的线粒体膜电位和细胞活力均下降，表明3-MA抑制自噬,细胞的损伤和死亡增多，提示自噬对H/R心肌细胞有保护作用。

缺血-再灌注会导致心肌细胞膜上Cx43的重构，包括数量、分布和磷酸化状态的改变，并造成心律失常易感性的增加[4-5]，而对线粒体上的Cx43蛋白，有研究显示，在经历90 min缺血后猪心肌中线粒体Cx43含量增加，考虑与其降解被抑制有关[6]。近期的研究[7]发现，通过CoCl2诱导H9c2心肌细胞缺氧3和6 h均引起线粒体Cx43水平明显升高，线粒体Cx43对缺氧心肌细胞有保护作用。本研究中，经历H/R过程后，H9c2细胞中线粒体Cx43总含量下降，且p-Cx43下降的幅度更大，说明复氧过程引起线粒体Cx43含量的下降，并造成线粒体Cx43的脱磷酸化。线粒体Cx43的磷酸化状态对维持线粒体结构和功能的稳定有重要意义[8-9]，推测线粒体Cx43含量下降和脱磷酸化可能是再灌注损伤发生的重要机制。GA是热休克蛋白90(HSP90)抑制剂，作为一种抗肿瘤药物被广泛研究，它可引起肿瘤细胞线粒体通透性增加、膜电位下降，以及细胞色素C释放，最终导致肿瘤细胞凋亡[10]。研究[3]结果表明，GA抑制HSP90介导的Cx43向线粒体膜转运，从而消除缺氧后处理对H/R心肌的保护作用。本研究利用GA抑制Cx43向线粒体内膜的转运发现，与H/R组相比，GA组线粒体Cx43和p-Cx43水平进一步降低，并引起线粒体膜电位和细胞活力的下降，证实了线粒体Cx43及其磷酸化状态的维持对H/R心肌的保护有重要作用。

研究[11-12]发现，自噬参与细胞膜上Cx43的降解，而在营养缺乏时Cx43的内吞和降解则可导致自噬的增加[13]，但自噬与线粒体Cx43间的关系鲜见报道。本研究发现，与H/R组相比，3-MA组线粒体p-Cx43明显减少，但线粒体Cx43水平的差异无统计学意义，表明抑制自噬后线粒体Cx43脱磷酸化增多，自噬对线粒体Cx43磷酸化的维持起重要作用。进一步比较GA+3-MA组与GA组的线粒体Cx43、p-Cx43水平，更加说明这一问题。本研究还发现，与H/R组相比，GA组线粒体Cx43、p-Cx43均较少，自噬水平明显下降；与3-MA组相比，GA+3-MA组线粒体Cx43总量无明显变化，而线粒体p-Cx43减少，自噬活性进一步降低，表明线粒体Cx43特别是p-Cx43可能是自噬激活信号通路中的重要一环。此外，通过比较各组线粒体膜电位和细胞活力发现，GA+3-MA组的线粒体膜电位和细胞活力下降最为显著，表明自噬与线粒体Cx43对心肌细胞的保护有协同作用。

综上所述，自噬参与线粒体Cx43磷酸化状态的维持，线粒体Cx43特别是p-Cx43也参与了自噬的激活过程，它们对H/R心肌起保护作用。靶向上调自噬水平与线粒体Cx43含量，改善线粒体Cx43磷酸化状态，可能成为今后治疗心肌缺血-再灌注损伤的重要手段。