浒苔染色体制备及核型初步分析

赵晓惠，施锦婷，2，张建恒，3，康新宇，丁晓玮，何培民，3，文钦琳，杨晓倩

（1.上海海洋大学海洋生态与环境学院，上海 201306；2.高知大学海洋植物学研究室，日本高知 783-8502；3.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，连云港 222005）

浒苔（Enteromorpha/Ulva prolifera）原属于绿藻门，绿藻纲，石莼目，石莼科，浒苔属（Enteromorpha），近年来国际上根据分子研究结果已倾向把浒苔属归为石莼属（Ulva）。它广泛分布于中、低潮区的砂砾、岩石、滩涂和石沼海岸中。浒苔藻体含有许多人体必需的营养成分，自古以来即作为食用和药用植物［1-2］，日本已大规模养殖，其产品价格在海藻中最高［3］。近十几年以来，许多国家都受到绿潮灾害的影响，其已成为全球性的海洋环境问题［4-5］。2008年，浒苔引发了我国黄海大规模绿潮暴发［6-7］，直接威胁2008年青岛奥帆赛举办，此后则成为我国黄海年年暴发绿潮主因［8-9］。目前，浒苔生活史、生理生态学、发育与进化生物学等关键问题正在深入研究，并且研究重点已开始转向功能基因分析与精细定位及分子遗传学等关键问题，因此浒苔染色体制备及核型分析研究越来越重要且十分迫切。

染色体制片和核型分析是研究重要功能基因定位、物种演化与分类、染色体遗传学等的重要环节［10-11］。由于大型海藻细胞壁结构特殊，采用传统染色体苏木精染色制备十分困难，至今仅海带和紫菜染色体制备和分型比较成功［12-13］。COLL等［14］最早采用钒铁苏木精染液对紫菜属的Porphyra leucosticta染色体核型进行研究，并且通过观察条斑紫菜（Porphyra yezoensis）和坛紫菜（Porphyra haitanensis）的壳孢子及其第1次和第2次萌发细胞染色体数目，才首次确认了紫菜减数分裂发生位置［15-16］。周伟等［17］采用苏木精染色可清晰地看到条斑紫菜和坛紫菜叶状体细胞分别为3条和5条染色体、丝状体细胞分别为6条和10条染色体。刘宇等［12］利用酶解-荧光法成功制备海带染色体，并可清晰辨认和分析核型；王浩东［18］最早尝试使用苏木精染色和常规压片法进行浒苔染色制备和观察研究，但浒苔染色体制作效果较差，难以准确进行倍性及核型分析。

为此，本研究借鉴海带染色体制备方法，采用酶解-荧光法探索浒苔染色体制备方法，通过大量实验研究出绿藻浒苔染色体制备过程中的3个关键条件，并获得了浒苔染色体核型清晰图谱，以期为未来浒苔遗传特征分析以及浒苔基因定位研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集与预处理

本实验选用材料为浒苔，于2018年5月采自江苏如东紫菜养殖区域，浒苔雌、雄配子体和孢子体由经典生活史方法进行判定［19］。选择生长状态较好的藻体，在温度为20℃、光照强度为130～150μmol·m-2·s-1、光照周期为12 L∶12 D条件下，于盛有400 mL VSE培养液［20］的三角瓶中充气培养，每周更换一次培养基。

1.2 染色体的制备

分别取1 cm生长状态良好的浒苔雌、雄配子体及孢子体，用灭菌海水清洗3～5次，放入1.5 mL离心管中，12 000 r·min-1离心2 min，去除多余水分，加入1 mL质量浓度为0.2%的秋水仙素［12］振荡摇匀，于4℃静置处理，并设置不同处理时间，分别为 4、8、12、16、20 h，以确定最适处理时间。

取秋水仙素处理的藻体，用去离子水漂洗2～3次，离心得沉淀；加入卡诺固定液（乙醇∶乙酸=3∶1）充分混匀后，于4℃处理24 h，将藻体细胞固定于有丝分裂中期，后离心得沉淀，用去离子水漂洗3次，离心取沉淀藻体，放入1.5 mL离心管中，加入质量浓度都为2%的纤维素酶、果胶酶、离析酶各100μL，充分混匀后放入37℃水浴锅中酶解4～24 h，设置不同梯度酶解时间分别为 4、8、12、16、20、24 h，以确定最适宜酶解时间；然后用70%的乙醇终止酶解反应，并用蒸馏水将酶解后的藻体漂洗3次，去除乙醇，离心得酶解产物沉淀，加入100μL冰乙酸并充分振荡混匀，取少量酶解产物，设置不同高度（10、30、50 cm）进行高位滴片，室温自然晾干。

1.3 染色体的观察与核型初步分析

取携带有染色体的自然晾干载玻片，避光加15μL DAPI（10μg·mL-1）溶液，盖上盖玻片，染色15 min后，在荧光显微镜（Leica DM4000B/DFC550，德国）下观察，将图片拍照保存。根据染色体数目判定标准：统计的细胞数目应在30个以上，其中85%以上的细胞具有恒定一致的染色体数，即可认为是该植物的染色体数目［21］。取5个典型中期细胞，测量并计算染色体绝对长度、相对长度和总长度及各平均值，计算方法参见李懋学等［21］的核型分析标准；最后根据染色体绝对长度，利用Adobe Photoshop软件按照由大到小顺序对浒苔细胞染色体进行编号并排序［22］。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素处理时间对染色体制备的影响

秋水仙素能有效抑制纺锤体的形成，秋水仙素处理时间对染色体分裂相、染色体浓缩程度及染色体形态有较大影响（图1）。秋水仙素处理时间表明：若处理时间过短（＜8 h），染色体大部分还处于染色质状态，难以清晰分辨染色体个体（图1-A，B）；若处理时间过长（＞16 h），造成染色体缩得过短，成极小的圆点状，显示不出染色体之间的差异（图1-D）；对于处理12 h左右的浒苔细胞，其染色体分裂相较多，染色体浓缩程度适宜，分散均匀，形态清晰（图1-C）。

2.2 酶解时间对染色体制备的影响

酶解程度的好坏直接影响到制片染色体的质量（图2），若酶解时间过短（＜16 h）（图2-A～D），细胞壁酶解不完全，细胞质有残留，细胞分散不均匀，染色体形态不易观察；若酶解时间过长（＞20 h）（图2-F），则染色体被降解，同样不能清楚观察染色体形态；实验发现，酶解20 h左右效果最好（图2-E），能去除细胞壁、细胞膜和多糖物质，使细胞分散均匀，染色体呈清晰点状或棒状。

图1 秋水仙素处理时间对浒苔染色体制备的影响Fig.1 Effect of different colchicine preparation time on chromosome preparation

图2 酶解时间对染色体制备的影响Fig.2 Effect of different enzym atic hydrolysis time on chromosome preparation

2.3 滴片高度对染色体制备的影响

滴片的作用主要是打破细胞外被和核膜，使染色体较好地分散在载玻片上以便于观察。不同高度进行滴片，能获得不同的染色体制片效果。结果显示，在10 cm左右高度下滴片（图3-A），染色体背景较模糊，不能使染色体较好的分散，不利于染色体的观察。当滴片高度为30 cm左右时（图3-B），能有效地分散染色体，获得较容易观察的染色体。而当高度大于50 cm（图3-C）进行滴片，染色体较为分散，很难区分单个细胞染色体。

2.4 核型初步分析

通过不断优化浒苔染色体制片方法后，获得清晰的浒苔染色体分裂相，其染色体分散较均匀，形态较清晰（图4）。本实验分别选取80个浒苔雌、雄配子体和孢子体细胞进行染色体数目的确定，93%（超过85%）的细胞染色体数目为雌、雄配子体n=9，孢子体2n=18。再按照染色体绝对长度由大到小进行染色体核型的初步分析（图4-D～F），统计5个中期细胞分裂相，雌性配子体的染色体绝对长度（表1）为1.249～3.490 μm，染色体总长度为21.286μm，平均长度为2.265μm；雄性配子体的染色体绝对长度为1.375～2.875μm，染色体总长度为 18.044μm，平均为2.005μm；雌配子体的染色体长度略大于雄配子体染色体，但他们的相对长度之间没有显著性差异。孢子体染色体的绝对长度为1.188～2.125μm，总长度为 26.242μm，平均长度为1.458μm。

图3 不同高度滴片对染色体制备的影响效果Fig.3 Effect of different drop heights on chromosome preparation

图4 浒苔雌、雄配子体及孢子体的染色体及其核型分析Fig.4 Chromosome images of the female，male gametophytes and sporophytes of U.prolifera and analysis of karyotypes

表1 浒苔雌、雄配子体及孢子体染色体长度（M eans±SD，n=5）Tab.1 Index of karyotype of U.prolifera

3 讨论

虽然目前植物染色体制片技术已较为成熟，但常规染色体制片技术仍存在不足之处［23-24］，而浒苔染色体很小，增加了对其染色体的观察难度，因此要获得分散良好且清晰的中期分裂相，需要对影响染色体制备过程的每一个关键因素进行最适范围摸索。预处理可破坏和抑制纺锤体中微管的形成，使中期分裂相的数量增加，促使染色体浓缩变短，利于染色体分散［25-26］。可用作预处理的药物很多，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉、α-溴萘、冰水等［10］，但不同植物进行预处理的最佳方式不同。杨玲等［25］利用对二氯苯-α-溴萘混合液预处理沙田柚根尖制片效果最好；李艳辉等［27］用8-羟基喹啉处理皱叶酸模，染色体制片效果最好；刘宇等［12］和唐历波等［28］分别以秋水仙素作为预处理试剂处理海带和白木香，取得了很好的染色体制片效果。由于浒苔与海带同属海藻，本研究选用秋水仙素作为预处理试剂，通过大量实验比较了不同浓度秋水仙素以及不同预处理时间对制片效果的影响，发现秋水仙素浓度对预处理效果影响不大，但其处理时间对实验结果有很大的影响，因此选取质量浓度为0.2%的秋水仙素［12］，本研究得出的秋水仙素最适预处理时间为12 h，这样可以积累大量处于分裂中期的染色体［29-30］。

固定剂可以中止细胞中的酶解反应或其他代谢活动，防止抗原丢失或被破坏，并保持细胞原有的结构和状态［26］，本研究所选用的卡诺固定液（无水乙醇∶冰乙酸=3∶1），目的是为了稳定染色体的结构，防止其分解，便于显微观察。研究结果表明，卡诺固定时间对制片效果无显著影响，但染色体在4℃下处理24 h，固定效果最佳，这与刘宇等［12］制备海带染色体的条件一致。

解离可以除去细胞间的果胶层并软化、破坏细胞壁［31］。不同的植物材料，解离液的选择和解离时间大不相同［32-33］，GILL等［34］用纤维素酶和果胶酶溶解细胞壁；陈瑞阳等［35］提出了酶解去壁低渗的制片方法，制片的染色体分散较好、形态较平整；刘宇等［12］用秋水仙素多种酶处理获得清晰的海带染色体。本研究所选用的解离方法为酶解法，在多种酶的作用下，经过酶解和压片后，分生细胞的原生质体从细胞壁中脱离出来，使得染色体周围不带细胞质或仅有少量细胞质，从而得到细胞背景干净、染色体分散较好的制片效果［10，12，36］。本研究酶解所用的每一种酶都是必不可少的，纤维素酶是一种在分解纤维素时起生物催化作用的酶，可以将纤维素分解为寡糖或单糖；果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解；离析酶的主要作用是把细胞从组织内分离出来，成为单细胞。酶解程度的好坏直接影响到染色体的质量，为了获得高质量的染色体分裂相，本研究通过大量实验得出最适酶解时间，即质量浓度为2%的纤维素酶、果胶酶、离析酶，混合酶解20 h所得染色体质量最高。

滴片的作用主要是打破细胞外被和核膜，使染色体较好地分散在载玻片上以便于观察。不同高度滴片能获得不同的染色体制片效果，本研究发现，若滴片高度低于30 cm，染色体背景较模糊，不能使细胞较好的分散，不利于染色体的观察；若滴片高度高于30 cm，则细胞与染色体较为分散，很难区分单个细胞染色体；只有在30 cm的滴片高度下才能获得高质量的染色体。此外，本实验选用灵敏度高、特异性的DAPI用于染色体的显带，方法简便，分辨率也很高［37］。DAPI复合物发出的荧光为浅蓝色，荧光显微镜观察细胞标记的效率高，发出的荧光更加稳定，便于显微照相［38］。

综上可知，影响浒苔染色体制片优劣的因素有很多，染色体制备过程中的每一步都十分关键。染色体制片的目的就是获得高质量的染色体，为后续的核型分析和原位杂交等研究提供先决条件。本研究发现，用质量浓度为0.2%的秋水仙素处理12 h，在获得大量处于分裂中期的染色体的基础上，用质量浓度为2%的纤维素酶、果胶酶、离析酶，混合酶解20 h，在30 cm高度下滴片，可以获得质量较高的染色体分裂相，所得浒苔雌、雄配子体染色体均为9条，孢子体的染色体为18条，呈短棒状或点状，并按照大小顺序对染色体的核型进行了初步分析，此结果为浒苔染色体进行核型分析以及浒苔基因定位研究奠定了基础，也可为未来浒苔全基因组的进一步分析提供重要依据。