烟台产区不同品种干红葡萄酒香气差异分析

刘弈彤 ，刘期成 ，李红娟 ，孔维府 ，阎立江 ，宋焕禄，沙 坤

（1.中国农业大学烟台研究院，山东烟台 264670；2.蓬莱市质量技术监督局，山东蓬莱 265600；3.北京工商大学，北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048）

挥发性香气成分是构成葡萄酒质量的一个重要因素，在葡萄酒的风格和个性化方面起主要作用。从香气来源方面来说，品种香是葡萄酒差异特征的主要来源，由于不同品种的葡萄组成成分的差异，构成各自品种典型独特的香气。Zhang 等[1]比较研究了中国赤霞珠、品丽珠、蛇龙珠品种新鲜红葡萄酒香气成分。结果表明，3 种葡萄酒中酸类含量最高，其次是醇类和酯类。蛇龙珠葡萄酒醇类和酯类，与赤霞珠和品丽珠葡萄酒相比，更加多样化。Tufariello等[2]研究了意大利本土葡萄品种黑曼罗酿制的红葡萄酒中挥发性香气成分，主要为醇类、酯类、酸类，其次是酮类、醛类、内酯，有少量酚类、含硫化合物被检出。此外，葡萄酒香气的形成也受到其他因素的影响，诸如葡萄产区的气候条件及土壤、栽培方式、采收成熟度和酿造工艺等[3-5]。

近年来，随着色谱、质谱等现代分析技术的发展，基于挥发性成分分析的多种技术方法用于葡萄酒的区别和分类。电子鼻是一种新兴的模拟人工嗅觉的电子系统，它以特定的传感器和模式识别系统快速提供被测样品的整体信息，指示样品的气味特征，具有客观、准确、快捷，重复性好及无损等优势[6]。通过电子鼻可实现对不同生产年份、品种及产区的葡萄酒的差异区分[7-8]。但是该技术无法实现对单个挥发性化合物的定性和定量。而SPME/GC-MS 技术的特点是可有效分离单个挥发性成分并鉴定其结构，已广泛应用于葡萄酒中的香气分析[9-11]。进一步采用OAV值法可确定每个化合物对样品整体风味的贡献[12-13]。

烟台是我国葡萄酒工业的发祥地和最大的葡萄酒产区，优越的地理和气候条件塑造了风格独特的优质葡萄酒，成为当地特色的地理标识产品。目前已有文献报道了烟台产区的赤霞珠[14]、蛇龙珠葡萄酒的香气成分[15]，而对其他新引进推广品种葡萄酒的香气特征鲜有报道。本研究拟采用电子鼻和SPME/GC-MS 技术分析烟台产区3 个品种干红葡萄酒中的挥发性成分，结合PCA 分析区分不同品种葡萄酒间的香气差异，并引入OAV 值对各种香气成分的贡献进行评价，研究将为葡萄酒风味品质评价、酿酒葡萄品种选育、风味品质调控等奠定重要理论基础，对加强地区特色产品原产地保护具有重要的社会意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：实验选取3 个品种干红葡萄酒（西拉、马瑟兰和美乐）样品来源于烟台蓬莱葡萄酒产区，每个品种葡萄酒采集自4 个不同生产厂家，均为2016年产的原酒，共计12个样品。

试剂及耗材：氯化钠为国产分析纯，2-甲基-3-庚酮、C7-C22系列烷烃，美国Sigma公司。

仪器设备：PEN3 便携式电子鼻系统，德国AIRSENSE 公司；7890A-7000B 气-质联用仪，美国安捷伦科技有限公司；DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm）色谱柱，美国J&W Scientific 公司；固相微萃取装置、50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取头，美国Supelco公司；XS105电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 电子鼻分析

样品前处理：称取1 mL 葡萄酒于20 mL 样品瓶中，加入9 mL 蒸馏水稀释，室温下静置10 min，至顶空气体达到平衡。设定载气流速400 mL/min条件下，让载气携带样品顶空气体经过传感器阵列，与传感器阵列接触，产生响应信号。信号检测时间设为120 s，清洗时间设为120 s，每个样品平行测定3 次，采集60 s 时的数据，每个品种葡萄酒样品取12个数据点进行PCA分析。

1.2.2 SPME/GC-MS分析

量取10 mL 葡萄酒，放入20 mL 萃取瓶中，加入6 g氯化钠，密封后置于50 ℃水浴中平衡20 min，然后插入固相萃取进样器，萃取40 min。之后将进样器插入气质联用仪，以250 ℃解吸7 min，同时启动仪器采集数据。

气谱条件：选用DB-WAX 毛细管柱，程序升温：起始温度40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 的速度升温到200 ℃，再以10 ℃/min 的速度升温到230 ℃，保持3 min，气化室温度250 ℃；载气为He，流速6 mL/min，分流比5∶1。

质谱条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，接口温度250 ℃，传输线温度280 ℃，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，扫描范围m/z 55～500。

化合物的定性通过保留时间与NIST2.0 质谱数据库比对进行鉴定，相似指数和反相似指数均大于800 的为鉴定化合物，同时使用标准系列烷烃(C7～C22)在相同气质测定条件下进行分析，测定化合物的保留时间并计算保留指数（Retention Indices，RI）[16]，并与文献中的RI值进行比较来鉴定化合物。

化合物的定量采用内标法，以0.41 mg/ mL 的2-甲基-3-庚酮为内标物，在顶空固相微萃取前加入到样品中，通过计算各检测化合物与内标物的峰面积之比求得其浓度，计算公式如下：

1.3 OAV值的计算

一种风味化合物对于某种食品风味的实际作用，取决于该化合物的风味阈值及其在该食品中的含量，常用OAV值来评价，计算公式如下：

式中：C——香气物质的质量分数，μg/L；T——感觉阈值，μg/L。

在既定条件下：OAV＜1，说明该组分对总体气味无实际作用；OAV＞1，说明该组分可能对总体气味有直接影响；且在一定范围内，OAV 值越大说明该组分对总体气味贡献越大。

1.4 数据处理

电子鼻数据PCA 分析使用仪器自带WINMUSTER 软件完成。挥发性成分数据的统计分析使用SPSS19.0 软件完成，数据间的差异分析采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 电子鼻分析烟台产区不同品种干红葡萄酒的香气差异

采用电子鼻对烟台产区3 个品种干红葡萄酒样品的整体香气差异进行比较分析，将3 组样品的电子鼻传感器响应值数据进行了PCA 分析，结果见图1。PC1 和PC2 累积方差贡献率已达到97.61%。由图1可以看出，美乐葡萄酒的数据点分布比较紧密，说明不同企业生产的样品间的香气比较接近，而马瑟兰和西拉葡萄酒的数据点分布相对分散，说明不同企业生产的样品间的香气差异较大。但是从3 组样品的整体分布来看，3 组样品分布在不同的区域，可以被PC1 和PC2 区分开，说明葡萄品种对制作的葡萄酒的整体香气有明显的影响。

2.2 SPME/GC-MS 分析烟台产区不同品种干红葡萄酒的挥发性成分

图1 3组葡萄酒样品电子鼻检测数据PCA分析

采用SPME/GC-MS 技术进一步进行鉴定和分析了3 个品种干红葡萄酒中的挥发性成分，结果见表1。从表1 可以看出，总共鉴定出7 类、48 种挥发性成分，包括22 种酯类、10 种醇类、5 种醛类、4 种酮类、3 种酸类、2 种酚类及2 种芳香烃类。3 组样品在挥发性成分的种类上并未有差异，主要表现为化合物含量的差异，除醛类和酮类外，其他各类化合物的总量存在显著差异（P＜0.05）。3 组样品在挥发性成分的组成上也存在差异，在西拉葡萄酒中，醇类（51.01 %）含量最高，其次是酯类（43.94%），再其次是酸类（2.30%），含有微量的醛类（1.27%）、酚类（0.96%）、酮类（0.52%）及芳香烃类（0.01%）；在马瑟兰葡萄酒中，酯类（52.18%）含量最高，其次是醇类（38.32 %），再其次是酮类（2.50 %），最后是醛类（2.27 %）、酸类（2.20 %）、酚类（2.09 %）及芳香烃类（0.44 %）；在美乐葡萄酒中，酯类物质含量最高（52.64 %），其次是醇类（41.30 %），再其次是醛类（2.72 %），最后是酸类（2.05%）、酮类（0.77%）、酚类（0.31%）及芳香烃类（0.21%）。上述3个品种与烟台产区蛇龙珠葡萄酒相比挥发性香气成分组成也存在一定差异，蛇龙珠中含量最高的是酸类、醇类和酯类，它们占总挥发性香气成分的99%以上[15]。

表1 烟台产区不同品种干红葡萄酒挥发性成分

续表1 烟台产区不同品种干红葡萄酒挥发性成分

酯类是检测种类最丰富的化合物，葡萄酒中的酯类产生于酵母或细菌的代谢及葡萄酒陈酿过程中[17]。酯类可以赋予葡萄酒果香和花香，是葡萄酒中最重要的香气物质。在酯类总含量上，西拉（2730.89 μg/L）和美乐（2440.29 μg/L）组要显著高于马瑟兰（1408.09 μg/L）组（P＜0.05）。对单个化合物来说，含量较高的是乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯等。

醇类是构成葡萄酒酒味特征的基本化合物，这些醇类一部分来源于葡萄浆果如萜烯醇（4-萜烯醇、α-松油醇、香茅醇等），属于植物次级代谢产物，其含量因植物品种而有差异[18-19]，另一部分葡萄酒中的高级醇（如异丁醇、1-戊醇、1-己醇、1-辛醇、1-壬醇等）则是酵母在酒精发酵过程中氨基酸或糖代谢的产物[20]。本研究检测的3组葡萄酒在醇类总含量上存在显著差异（P＜0.05），顺序为西拉（3170.07 μg/L）＞美乐（1914.51 μg/L）＞马瑟兰（1034.13 μg/L）。对单个化合物来说，含量较高的是苯乙醇和1-戊醇，它们分别表现出甜香、玫瑰香和水果、香油味。

本研究检测到3 种酸类（己酸、辛酸和癸酸），它们主要产生于发酵过程中醛类的氧化，其浓度取决于未发酵葡萄汁的初始成分及发酵条件[21]。C6—C10脂肪酸类通常在低质量浓度时表现出奶酪、奶油香气，而在高质量浓度时会使葡萄酒带有酸败、粗糙的气味[22]。本研究中3 种酸类的含量均较低，产生不愉快风味的影响有限。此外，C6—C10脂肪酸类对于葡萄酒的香气平衡起积极作用，因为它们可以抑制与其对应乙醇酯类物质的降解[23]。

醛类是酒精饮料中常见的香气成分，该类化合物产生于酒精发酵过程中，借助酵母催化由丙酮酸盐脱羧生成[24]。在醛类总含量上，3 组葡萄酒之间并无显著差异（P＞0.05）。壬醛和糠醛可提供辛辣味，己醛和癸醛呈现青草味，苯甲醛呈现扁桃仁味。

本研究检测到5 种酮类（2-（甲酰氧基）-1-苯基-乙酮、3,4,4a,5,6,7-六氢-1,1,4a-三甲基-2（1H）-萘酮、4'-（三氟甲基）苯乙酮及5-丁基-二氢-4-甲基-2（3H）-呋喃酮），在其总含量上3组葡萄酒之间并无显著差异（P＞0.05）。

本研究仅检测到两种酚类（4-乙基-苯酚和2,4-双（1,1-二甲基乙基）-苯酚），葡萄酒中挥发性酚类的来源可能与Brettanomyces 酵母代谢活性有关[25]，也可能来自陈酿过程中橡木溶解的成分[26]。从酚类总含量来看，西拉和马瑟兰组要显著高于美乐组（P＜0.05）。4-乙基-苯酚呈现出葡萄汁味，2,4-双（1,1-二甲基乙基）-苯酚呈现出酚味。

芳香烃类（苯乙烯和1,2-二氢-1,1,6-三甲基-萘）在检测样品中含量较低，从其总含量上看，马瑟兰和美乐组要显著高于西拉组（P＜0.05）。

2.3 挥发性成分的PCA分析（图2、图3）

将3 个品种干红葡萄酒中的挥发性成分进一步进行了PCA 分析，结果见图2 和图3。PC1 和PC2 分别解释了总方差的46.71%和22.07%，累积方差贡献率为68.78%。

图2 3组葡萄酒样品在前两个主成分上的分布

图3 各挥发性成分在前两个主成分上的分布

图2 为各样品在PC1 和PC2 上的分布，由图可见，3组样品分布在不同象限，可以被PC1和PC2区分开，说明3 组样品在挥发性成分的组成上有明显差异，西拉葡萄酒分布在PC1 的正半轴，与马瑟兰和美乐葡萄酒相距较远，这与电子鼻分析的结果是一致的。

图3 为各挥发性成分在PC1 和PC2 上的分布，由图可见，与PC1 高度相关的化合物主要有乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基-丁酸乙酯、3-甲基-丁酸乙酯、氨基甲酸甲酯、2-呋喃羧酸乙酯、丁二酸二乙酯、异丁醇、1-戊醇、1-己醇、α-松油醇、癸醛、己酸等，它们分布在PC1 的正半轴，结合图2 可以看出它们在西拉葡萄酒中含量较高；与PC2 高度相关的化合物主要有乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸异戊酯、水杨酸甲酯、癸酸乙酯、己醛等，它们分布在PC2 的正半轴，结合图2 可以看出它们在美乐葡萄酒中含量较高。

2.4 OAV 值评价烟台产区不同品种干红葡萄酒的香气质量

采用OAV 值评价各香气成分对葡萄酒风味的实际贡献，3 组葡萄酒香气成分的阈值、OAV 及气味描述见表1。

由表1可知，3组样品中鉴定出的OAV＞1的活性香气成分有8 种，包括2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基-丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯及壬醛，说明这些成分将对葡萄酒香气产生直接影响。其中，辛酸乙酯在3 组葡萄酒中均是OAV 值最高的，且美乐组要显著（P＜0.05）高于西拉和马瑟兰组，它具有凤梨香、梨香、花香。其次是壬醛，亦是美乐组显著（P＜0.05）高于西拉组和马瑟兰组，它具有辛辣味。再其次是己酸乙酯，亦是美乐组显著（P＜0.05）高于西拉组和马瑟兰组，它具有青苹果味、果香、草莓香、大茴香味。将8 种活性香气成分的OAV 值总量进行计算，3种葡萄酒的OAV值排序为美乐（560.83）＞马瑟兰（295.57）＞西拉（277.62）。

3 结论

3.1 电子鼻检测技术结合PCA 分析可以有效区分烟台产区的3种干红葡萄酒的香气组成。

3.2 采用SPME/GC-MS 法从3 组葡萄酒中共检出48 种挥发性成分，包括22 种酯类、10 种醇类、5 种醛类、4 种酮类、3 种酸类、2 种酚类及2 种芳香烃类。3 组样品在挥发性成分的种类上没有差异，主要表现为含量的差异，除醛类和酮类外，其他各类化合物的总量存在显著差异（P＜0.05）。PCA 分析结果表明，3 组样品在挥发性成分的组成上有明显差异。

3.3 OAV值法共鉴定出8种活性香气成分（OAV＞1），包括2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基-丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯及壬醛，它们对葡萄酒香气的形成有直接影响。