海葵基底附生酵母的分离鉴定与乙醇发酵效率研究

张本旭 ，于红霞 ，李夏云，邢 翔

（1.山东大学海洋学院，山东威海 264209；2.山东颐阳集团，山东威海 264400）

随着石化资源的枯竭，人们的环保意识不断增强。乙醇被誉为可再生绿色能源燃料，由于其燃烧污染小、容易运输和贮藏，在价格上乙醇也可与汽油相竞争，因此具有巨大的开发前景。目前我们的工业酿酒酵母菌大都来自于陆地环境。2000 年出版的《YEASTS，Characteristics and Identification，Third Edition》中，Barnett 等人描述了678 种酵母菌，其中51 种来自海洋环境。海洋占整个地球面积的70%，其中有丰富的生物资源，包括酵母菌和酵母菌基因资源[1]。

近些年来研究表明，海洋微生物可与多种海洋无脊椎动物形成共附生关系而且可能是某些天然产物最初的合成者[2]。海葵分布广泛，从潮间带到深渊海底、从热带水域到两极海域的多种海洋环境中（包括海底热液和冷泉）都有它们的踪迹，而且在一些海域中生物量很大，为优势种[3]。与海葵形成共附生关系的部分海洋酵母种类具有发酵乙醇的功能，由于海洋的高渗环境，海洋酵母菌与淡水酵母菌相比有耐盐性好、抗逆性强等优点。本实验将对从海葵附着层中获得的4 株酵母菌的发酵性能进行比较，并选取发酵性能较好、有较大提升潜力的1 株酵母菌，优化其发酵条件，通过正交试验找到最优发酵条件，以提升酵母菌的发酵效率。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：本实验从黄海、渤海海域麻子港（37.534014，122.066834），南山咀（37.522151，122.163179）中采集到若干株海葵及附着层样本，分离筛选获得4 株海洋酵母菌。在试验中分别命名为S4、ZE、DB、A1。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌生长曲线测定[4]

取20 个100 mL 三角瓶分别装入30 mL 的YPD液体培养基，灭菌后编号其中一个标注为空白对照，以0.5%的接种量接种，置于28 ℃，120 r/min的培养箱中培养，每间隔4 h取出三角瓶，测定该瓶中的菌悬液OD值[5]。

按照空白对照调节分光光度计0 位，在600 nm波长下测定酵母菌不同生长时间培养液的OD600值，测定3 次取其平均值。若菌悬液浓度太高，应当适当稀释使OD 值在0.1～0.8 之间，并记录相应培养液的培养时间、稀释倍数、OD600值，绘制生长曲线。

1.2.2 酵母菌发酵性能测定

1.2.2.1 CO2释放量测定实验

酵母菌在无氧条件下通过呼吸作用，将糖类转化为乙醇，并放出二氧化碳，以上过程可表示为。由此式可知，通过记录发酵过程中产生的CO2含量可计算发酵产生乙醇的含量，继而表征发酵效率。

配制100 mL YPD 发酵培养基，按10%的接种量接入种子液，同时将未接种的发酵培养基作为对照，称重后放入摇床培养箱中，在28 ℃、120 r/min的条件下培养。发酵过程中每隔24 h 取出称重，直至发酵液前后质量差与对照组质量差相当，即认为发酵终止。计算排气前后重量差，即CO2释放量。由方程式计算可知，CO2释放量∶乙醇=22∶23，可间接计算出乙醇产生量。

1.2.2.2 发酵液酒精度测定（酒精计法）

将发酵完成的发酵液转移至500 mL 蒸馏瓶中，加入50 mL 蒸馏水，用减压蒸馏装置蒸馏出100 mL 溶液，用酒精比重计测定所得溶液的乙醇度，以及溶液温度，换算得20 ℃时的酒精度。1.2.2.3 发酵液酒精度测定（重铬酸钾比色法）

酒精计法测定乙醇含量较为粗略，故选用重铬酸钾比色法来精确测定样品中的乙醇浓度，此方法通过乙醇在酸性条件下与重铬酸钾反应生成三价铬离子（Cr3+），铬离子在600 nm 处有吸收峰，可利用吸光度值计算溶液中的乙醇含量。公式：

重铬酸钾比色法标准曲线的绘制：取0.2 g 无水乙醇加入100 mL 容量瓶中配制为体积分数为0.25%的乙醇标准溶液，由乙醇密度计算得每毫升标准溶液中有约2.0 mg乙醇。另取5 g重铬酸钾溶于蒸馏水中，加入10 mL 浓硫酸放置至室温后加蒸馏水定容至100 mL，得到5 %重铬酸钾酸性溶液。分别向1～8号试管中加入乙醇标准溶液0～7.0 mL后，加入2.0 mL 的5 %重铬酸钾酸性溶液，最终定容至10 mL。将准备好的试管放置于沸水浴中加热反应10 min，取出并冷却至室温，将1号管作为空白对照将分光光度计调零，其余试管于波长600 nm处测定吸光度，每组重复一次取平均值，以乙醇浓度与对应的吸光度作标准曲线[6]。

发酵液样品乙醇含量测定：取蒸馏后产物0.25 mL 于试管中，加入2.0 mL 的5 %重铬酸钾酸性溶液，加水定容至10 mL，沸水浴加热10 min 后冷却至室温，于波长600 nm 处测定吸光度，每组样品平行测定3 次求平均值，后通过标准曲线计算得出样品中的乙醇含量。

1.2.3 单因素试验[7]

通过生长曲线的测定和发酵性能的测定，选取生长状况较好、发酵性能较优的1 株酵母菌ZE，对影响其发酵效率的因素进行单因素条件优化。

1.2.3.1 发酵温度的影响

菌种活化后，按照体积分数10.0%的接种量接种5 瓶YPD 发酵培养基，分别将其放置于25～38 ℃5 个发酵温度下，以120 r/min 摇床培养24 h，每个温度梯度做1 次平行。记录发酵前后锥形瓶重量变化，计算CO2释放量及乙醇产生量。

1.2.3.2 发酵碳源的影响

将葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、麦芽糖、阿拉伯糖、半乳糖以2%的浓度分别加入基础氮源培养基中配制成发酵培养基，并装液于带杜氏管的试管中。将活化后的菌液以1 %的接种量接种于试管中培养24 h，每组重复两次，记录杜氏管中产气情况。

1.2.3.3 发酵氮源的影响

将培养基中的氮源分别替换为硫酸铵、硝酸钾、尿素、蛋白胨、酵母粉以制备不同氮源的发酵培养基。菌种活化后，将它们以10.0%的体积分数接种，并置于28 ℃、120 r/min摇床培养箱中培养24 h。记录发酵前后锥形瓶重量变化，并计算CO2排放量及乙醇产生量。

1.2.3.4 发酵培养基pH值的影响

调节发酵培养液pH4.5～6.5。菌种活化后，将其以10.0%的体积分数接种，置于28 ℃、120 r/min摇床培养箱中培养24 h，每组做1 次重复。记录发酵前后锥形瓶重量变化，计算CO2释放量及乙醇产生量。

1.2.3.5 发酵氮源浓度的影响

根据氮源实验结果，选择最适氮源，制备氮源浓度分别为1 %～5 %的发酵培养基。菌株活化后，将它们以10.0 %的体积分数接种，并置于28 ℃、120 r/min摇床培养箱中培养24 h。记录发酵前后锥形瓶重量变化，计算CO2排放量及乙醇产生量。

1.2.3.6 发酵碳源浓度的影响

根据碳源发酵实验结果选择最适的碳源，配制碳源浓度分别为16%～28%的发酵培养基。菌种活化后，将它们以10.0 %体积分数接种，置于28 ℃、120 r/min 摇床培养箱中培养24 h，每组做1次平行。记录发酵前后锥形瓶重量变化，计算CO2释放量及乙醇产生量。

1.2.4 正交试验

根据单因素试验结果，选取发酵温度、氮源浓度、发酵液pH 值3 个对发酵产量有明显影响的因素，设计3 因素3 水平的正交试验，采用L9(34)的正交表对酵母菌发酵条件进行优化[8]，见表1。

表1 发酵优化正交试验因素水平设计(一)

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定OD600（图1）

图1 4种酵母菌的生长曲线

由图1 可知，对于菌株A1，在培养0～4 h 为延滞期，4～28 h 为对数生长期，28～72 h 为稳定期，在试验阶段中未观测到衰亡期。对于菌株ZE、S4、DB，在培养0～8 h 为延滞期，8～42 h 为对数生长期，42～72 h 为稳定期，未见明显衰亡期。菌株DB、S4、ZE 相比菌株A1 在达到稳定期时的菌种数量占有明显的优势。

2.2 CO2释放量测定（图2）

图2 CO2释放量变化曲线

由图2 可知，4 种酵母菌的CO2释放量均随着发酵时间的延长逐渐减少，即在发酵的前24 h 时，发酵效率最大，随后产生的CO2含量减少，即单位时间发酵产生的乙醇含量减少。可推断由于发酵产生的乙醇在发酵液中积累，随着发酵时间的延长，发酵液中的乙醇浓度逐渐升高，而乙醇浓度的升高会抑制酵母菌的生长及其发酵过程，整个发酵过程中的CO2释放量随发酵时间的延长逐渐减少，因此在后续试验中选取前24 h 的CO2释放量作为发酵效率高低的比较指标。

在发酵开始后7 d，A1 和ZE 菌株的CO2释放量接近0 g，在发酵开始后10 d的S4和DB菌株的CO2释放量接近0 g，其微小的数值可能为摇瓶时的水蒸汽蒸发所致，因此可推断A1 与ZE 在发酵后第7天、S4 与DB 在发酵后第10 天，锥形瓶重量基本不发生变化，判定认为发酵完成。

由图2 可知，CO2日释放量在发酵开始后5 d 时间 内ZE＞A1＞DB＞S4，之 后 有S4＞DB＞ZE=A1。另将每24 h 的CO2释放量相加可得CO2总释放量，其中ZE 在发酵过程中共释放CO244.1 g、A1共释放CO236.2 g、S4 共释放CO231.0 g、DB 共释放CO232.1 g，ZE 在发酵过程中释放的CO2明显高于其他3株酵母菌。

2.3 乙醇含量测定

由实验测得每组试管中的乙醇含量及其在600 nm波长处的OD600值，绘制标准曲线，见图3。

图3 分光光度法测定乙醇标准曲线

图3结果表明，反应中乙醇浓度在0～14 mg/10 mL范围内，乙醇浓度与相应的OD600呈良好的线性关系，线性回归方程为y=0.0512x，其相关系数R2为0.9948。将测量所得样品OD600取平均值后计算得到相应的乙醇含量A，换算成20 ℃的酒精度X，按下式计算：

式中：X为酒精度（100 mL溶液中所含的乙醇体积数）；A 为通过标准曲线计算得样品中乙醇含量（mg）；V 为取酒样体积（mL）；ρ乙醇为20 ℃时乙醇密度（g/mL）。

图4 4种酵母菌的发酵液酒精度测定值

相比较酒精计测量蒸馏液酒精度和重铬酸钾分光光度法测量酒精度法，两种方法所测得数值稍有偏差（图4），可能由于酒精计测量的误差大导致。但从数据趋势来看，均有ZE＞S4＞DB＞A1，其中ZE 在发酵完成时的酒精度为3.676 %vol，明显高于其他3 种酵母菌，可判断在28 ℃、120 r/min培养条件下ZE 发酵乙醇效率较高。结合生长曲线以及CO2释放实验，选取生长状况较好、发酵产量较高的ZE 菌株进行其发酵条件的优化选择、以找到发酵的最优条件搭配。

2.4 单因素条件优化

2.4.1 发酵温度对发酵效率的影响（图5）

图5 发酵温度对ZE发酵效率的影响

温度是菌内酶反应的速度以及菌体生长速度的重要影响因素。由图5 可知，温度对于菌种发酵产率有明显的影响，当发酵温度为33 ℃时，CO2释放量最高，且相较其他温度差异显著，可推断菌种在25～38 ℃温度范围内，发酵效率先升高后下降，在33 ℃附近达到峰值，因此选择33 ℃作为最优发酵温度。

2.4.2 发酵培养基中氮源对发酵效率的影响（图6）

图6 氮源种类对ZE发酵效率的影响

氮源是酵母菌合成自身所需蛋白质、核酸等含氮物质的重要原材料，不同的氮源对微生物有不同的生理学效应。实验测试了6 种不同氮源进行发酵，其中硫酸铵、硝酸钾、尿素为无机氮源，蛋白胨、酵母浸粉以及两者以2∶1 的配比混合所得的混合氮源为有机氮源。由图6 数据可知，菌种对蛋白胨和酵母浸粉以及两者的混合氮源即3 种有机氮源较为适应，有较高的CO2释放量即较高的发酵产量，相较硫酸铵、硝酸钾和尿素有明显差异。当采用混合氮源进行发酵时，CO2释放量最高，但相较其他两种单一氮源差异不明显。

图7 氮源浓度对ZE发酵效率的影响

由图7 可知，随着氮源浓度逐渐增加，CO2释放量先增加后减少，在氮源浓度为3 %时达到最大，相较其他浓度下的释放量差异明显，因此选择3%的氮源浓度且为蛋白胨∶酵母浸粉为2∶1 的混合氮源作为最优氮源进行后续实验。

2.4.3 发酵培养基中碳源对发酵效率的影响

碳源是指微生物生长繁殖的营养源，为微生物提供所需的碳元素，由于不同微生物所产生酶系不同，因此利用不同碳源的程度也存在差异[9]。通过糖发酵实验可得，在杜氏管中产生气泡的仅葡萄糖，蔗糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖杜氏管中均无气泡。未产生气泡的几组实验说明，该菌种可能缺少利用此类糖类的酶系，无法在该培养基中发酵产生乙醇并放出CO2，实验中菌种可利用的碳源仅为葡萄糖，均无法将其他碳源转化为乙醇。将碳源浓度设置为16 %～28 %，再测量每组减重。

由图8 可知，当碳源浓度在22 %以下时，该菌种的CO2释放量相近无明显差异，当碳源浓度达24 %时，CO2释放量有所下降，当碳源浓度上升至26%、28%时，该菌种CO2释放量显著降低，发酵效率下降。碳源浓度增高意味着培养液黏度增大、渗透压增高、培养液中氧含量下降等物理变化，可能会影响到酵母菌的生长以及发酵效率，因此过高的

图8 碳源浓度对ZE发酵效率的影响

碳源浓度会导致发酵效率下降。而碳源浓度在22 %以下时，未对菌种的生长及发酵产生明显影响，而碳源作为发酵过程的底物在浓度未影响酵母菌生长及发酵时，底物浓度越大，则底物质量越大，在一定范围内能够使菌种发酵完全，因此选择碳源为葡萄糖，浓度为20%进行下一步实验。

2.4.4 发酵培养基的初始pH 值对发酵效率的影响（见图9）

图9 发酵液初始pH值对ZE发酵效率的影响

发酵液的pH 值会对酵母的生命活动及酶的活性产生影响，酵母菌的适宜生长条件为弱酸性，pH值过低会增加酵母细胞排除质子的能量消耗并降低酵母细胞活度以及酵母对基质的利用速率[7]。从图9 可知，随着发酵液初始pH 值的升高，CO2释放量即发酵效率呈现先增加后下降的趋势，当pH 值为5.5 时，发酵效率最高，因此选取pH5.5 进行下一步实验。

2.5 酵母菌发酵条件优化结果（表2）

正交实验结果如表2，发酵温度、发酵液pH值、氮源浓度3 个因素对CO2释放量的影响数值R 可判断各因素对发酵效率的影响主次顺序为A＞C＞B，即发酵温度＞氮源浓度＞发酵液pH 值。较优因素组合为A3B2C1即发酵温度为38 ℃，发酵液pH值为5.0，氮源浓度为2%，理论最优与实验结果最优一致。

表2 正交试验结果

2.6 分子生物学鉴定结果

经鉴定，4 株菌株分别为A1：Hanseniaspora pseudoguilliermondi；S4、ZE：[Candida]duobushaemulonis；DB：Sporobolomyces carnicolor。

3 小结

本实验从海葵着生层中分离出4 株酵母菌，测定其生长曲线。并对4 株菌进行发酵性能的简单测定，选取生长状况较好、发酵产量较高的ZE 菌株进行其发酵条件的优化选择。对其从温度、pH、氮源、碳源等因素进行优化。最终选取发酵温度、氮源浓度、发酵液pH 值3 个对发酵产量有明显影响的因素，设计3因素3水平的正交试验。结果表明，实验菌株在发酵温度为38 ℃、发酵液pH 为5.0、氮源浓度为2 %，葡萄糖浓度为20 %时，乙醇发酵效率较高，24 h CO2释放量为1.826 g。上述发酵液继续发酵7 d 至发酵终止，蒸馏发酵液采用重铬酸钾分光光度法测定发酵液酒精度为4.056%vol，相比原发酵配方酒精度提高了10.3%。

ZE 菌株在发酵温度为38 ℃、发酵液pH5.0、氮源浓度为2 %，葡萄糖浓度为20 %时，发酵液乙醇浓度可达到4.056 %vol，具有良好的乙醇发酵能力。郑虹、杜可[10]在其对高产乙醇的酵母发酵特性研究中发现，当发酵液中葡萄糖初始浓度为200 g/L，用于研究的菌株的生物量和乙醇度达到最大值，菌株的生物量在2.0 左右，而乙醇产量在8.5%左右；Oshoma[11]在其研究中，酵母对氮的最适利用浓度为0.80 gN/L，并且硫酸铵为最适氮源；Mbajiuka[12]在发酵蔗糖实验中测定所用酵母菌最适初始温度25 ℃、24 °Bx、pH 值4.0 时，发酵后酒精度达到10.5 %vol；而张莉、张兰[13]在其研究中也得到相似的结论，这与本实验中酵母的最适发酵条件有较大差别，推测是由于酵母菌的种类不同，其最适发酵条件也有所改变；邓永东，李静红[14]在对1株热带假丝酵母菌发酵条件的研究中，其为发酵时间72 h，发酵温度36 ℃，初始pH4，葡萄糖乙醇发酵理论得率为0.51 g 乙醇/g 葡萄糖，与本实验结论接近。通过与其他实验室的研究证明了本实验的菌株有良好的发酵乙醇的能力。该菌种来源于海洋环境下分离得到的野生菌种、在未来的实验中还可对其进行遗传改造进一步提高其乙醇发酵能力，具有巨大的开发潜力。