香椿子正丁醇提取物通过激活Nrf2改善高糖引起的肾小球内皮细胞氧化应激

仲玉鑫 ，胡珊 ，王婷婷 ，张雨淼 ，李万忠 ，于丽 ，刘雨清 ，张红霞 *

（潍坊医学院1临床医学院临床病理学系，2神经疾病与再生修复实验室，3组织学与胚胎学教研室，4附属医院肾内科，5药学院药剂学教研室，潍坊 261053）

香椿子是楝科植物香椿干燥成熟的果实，主要成分有黄酮、多元酚、倍半萜烯等，具有抗肿瘤、降糖、抗炎、抗氧化等[1-4]多种作用。香椿子石油醚提取物能够通过抑制氧化应激改善DN（diabetic nephropathy, DN）大鼠的肾脏损伤[2]。香椿子提取物对不同肾脏细胞的具体作用及机制，尚不清楚。

肾小球内皮细胞（glomerular endothelial cells，GEC）是有窗孔的特殊内皮细胞，被覆一层200～400nm厚的多糖-蛋白质复合物，与肾小球滤过功能有关系。近年来肾小球内皮细胞逐渐成为糖尿病肾病研究的热点，高糖引起的氧化应激是导致内皮功能障碍的重要因素[5-7]。本研究中，我们主要研究香椿子正丁醇提取物能否改善高糖引起的肾小球内皮细胞氧化应激并探讨可能的机制。

材料与方法

1 主要试剂

兔抗Nrf2购自美国Sigma-Aldrich公司；鼠抗HO-1、NQO1、p47phox购自美国Santa Cruz公司；鼠抗GAPDH购自美国Cell Signaling Technology公司；硝酸还原酶法一氧化氮（NO）试剂盒购自南京建成；活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；RPMI-1640细胞培养液购自美国Hyclone公司；细胞培养板购自美国Corning公司；香椿子正丁醇提取物（n-butyl alcohol extract ofToona sinensis，NBAE）由潍坊医学院药学专业实验室提供。

2 人肾小球内皮细胞培养及处理

人肾小球内皮细胞（human renal glomerular endothelial cells, HRGEC, 购自北纳创联生物技术有限公司）于37℃细胞培养箱（95%O2，5%CO2）中，用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI-1640培养液培养传代，取3～10代进行实验。将HRGEC以适当密度接种，单层细胞密度达到80%后分为4组：空白组、高糖组（HG组，25mmol/L D-葡萄糖）、HG+NBAE组（培养基为不完全培养基与NBAE大鼠血清的混合物，二者之比为9:1），培养24h后观察。

3 DCFDA法检测细胞内总ROS

将细胞接种入6孔板中，培养细胞至适当密度，按照上面实验分组中所述方法作用24h后弃去原培养液，PBS洗3次，加入终浓度为2μmol/L的DCFHDA液2ml，置于37℃细胞培养箱避光孵育30min，无血清细胞培养液洗涤细胞3次，于荧光显微镜下直接观察并拍摄图片，用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件分析平均光密度以表示细胞内 ROS 的含量。

4 Nitrate/Nitrite Colorimetric法检测NO含量

实验分组与2相同，取各组细胞上清液，采用硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO含量，详细操作按照试剂盒内说明书进行。NO 含量值按照说明书给出的公式计算：

5 Western blot

将HRGEC进行相应处理24h后，裂解细胞提取其总蛋白质行8% SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜，用3% 脱脂奶粉+2% BSA室温下封闭2h，分别加入相应一抗，4℃孵育过夜。次日TBST洗涤3次后加二抗室温孵育1h，再次TBST洗涤3次，ECL化学发光法显影，X线胶片曝光，采用Image J图像分析系统对各条带灰度值进行分析，以目的蛋白条带吸光度与内参照GAPDH条带吸光度的比值反映目的蛋白的表达水平。

6 免疫荧光染色

用 PBS 洗涤细胞2次，5% 多聚甲醛固定5min，PBS 洗3次每次5min；1% 羊血清封闭 15min；稀释适量比例的一抗（阴性对照用 PBS 代替一抗）孵育过夜，PBS 洗3次每次5min；1:200稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG（1:200稀释的TRITC标记的羊抗兔IgG） 孵育 30min，PBS 洗3次每次5min；Hoechst33342常温下孵育5min染核，PBS 洗2次每次3min；含荧光淬灭剂的封片剂封片，荧光显微镜下观察并拍照。

7 统计学处理

使用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析，所有实验数据以均数±标准差表示。 不同处理组之间行独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 NBAE降低人肾小球内皮细胞高糖诱导的ROS水平

DCFDA法检测ROS结果显示，与空白对照组相比，HG组细胞内ROS水平明显增高（图1、图2）。与HG组相比，HG+NBAE组细胞ROS水平明显下降，NBAE明显降低高糖诱导的ROS水平（图1、图2）。此结果表明，高糖刺激可诱导肾小球内皮细胞氧化应激的发生，而NBAE可抑制氧化应激，降低ROS水平。

图1 高糖和NBAE对人肾小球内皮细胞内ROS水平影响的DCFDA法检测。A，Ctrl组；B，HG组；C，HG+NBAE组；比例尺，50μm Fig. 1 Effect of high glucose and NBAE on ROS level in the glomerular endothelial cells detected by DCFDA method. A, Ctrl group； B, HG group； C,HG+NBAE group； scale bar, 50μm

图2 高糖和/或NBAE对人肾小球内皮细胞内ROS水平影响的定量分析。A, Ctrl组ROS水平 B, HG组ROS水平 C, HG+NBAE组ROS水平 D, 不同处理组ROS水平的统计学分析；***P＜0.001，与Ctrl组相比；#0.01＜P＜0.05与HG组相比，n=3Fig 2. Quantitative analysis for effect of high glucose and/or NBAE on ROS level in the glomerular endothelial cells. A, Ctrl group ROS level； B, HG group ROS level； C, HG+NBAE group ROS level； D, statistic analysis of ROS level in different treatment groups； ***P＜0.001, compared with Ctrl group； #0.01＜P＜0.05, compared with HG group, n=3

2 NBAE抑制人肾小球内皮细胞高糖导致的p47phox表达增高

P47phox是NADPH氧化酶的一个催化亚单位，主要位于胞质内，其表达增加可以上调NADPH氧化酶活性[8,9]，故抑制p47phox表达能够降低NADPH氧化酶的表达，从而减轻氧化应激。免疫荧光染色显示，p47phox细胞内的分布主要在细胞质中；与Ctrl组相比，HG组中p47phox在胞质内平均光密度值显著增高（图3B），且p47phox的表达增高主要聚集在细胞一侧（图3A）；与HG组相比，HG+NBAE组中p47phox在胞质平均光密度值明显降低，并且减轻高糖导致的局部表达增高，使p47phox在胞质中均匀表达（图3B）。结果表明高浓度葡萄糖能够刺激 p47phox 在胞质内表达量增高，NBAE能够抑制高浓度葡萄糖所致的p47phox的表达上调。

图3 高糖和/或NBAE对人肾小球内皮细胞内p47phox水平和分布影响的免疫荧光检测。A, p47phox免疫荧光染色（比例尺，20μm）与p47phox免疫反应性的定量检测；B, p47phox免疫反应性的统计学分析；与Ctrl组相比，*0.01＜P＜0.05；与HG组相比，#0.01＜P＜0.05；n=3Fig. 3 Immunofluorescence detection for effect of high glucose and / or NBAE on the level and distribution of p47phox in the glomerular endothelial cells. A, imunofluorescence staining of p47phox (scale bar, 20μm) and quantitation of p47phox immunoreactivity； B, statistical analysis of p47phox immunoreactivity； *0.01＜P＜0.05, compared with Ctrl group； #0.01＜P＜0.05 compared with HG group； n=3

3 NBAE部分阻抑人肾小球内皮细胞内高糖所致的NO水平降低

Nitrate/Nitrite Colorimetric法检测NO结果显示，空白组NO含量为77.19±11.43μmol/L，HG组NO水平较Ctrl组明显降低，约降低一半；HG+NBAE组NO水平较HG组升高（表1），表明NBAE能在一定程度上抑制人肾小球内皮细胞内高糖所致的NO水平降低。

表1 高糖和/或NBAE处理人肾小球内皮细胞中NO水平比较Tab. 1 Comparison of NO levels in the glomerular endothelial cells treated with high glucose and/or NBAE

4 NBAE对高糖诱导的Nrf2通路活性的影响

免疫荧光染色显示，在空白对照组可见Nrf2在细胞质中均匀表达；在HG组和HG+NBAE处理组中，Nrf2在细胞核内高表达，说明高糖、NBAE能够刺激Nrf2向核内易位。Western blot结果显示，与空白对照组相比，HG组Nrf2水平和Nrf2的下游蛋白NQO1与HO-1水平降低（图4）；与HG组相比，HG+NBAE处理组的Nrf2水平显著增加（图4）；随着Nrf2的激活，NQO1和HO-1也被激活，与HG组相比，HG+NBAE处理组的NQO1和HO-1水平也显著升高（图4）。

图4 高糖和/或NBAE对人肾小球内皮细胞内Nrf2、NQO1及HO-1水平的影响。A，免疫荧光染色检测Nrf2水平和定位变化（比例尺，20μm）；B, Western blot 分别检测Nrf2、NQO1及HO-1水平变化，GAPDH为内参照；C, Nrf2、NQO1及HO-1水平的统计学分析；*0.01＜P＜0.05，与 Ctrl组相比；与 HG 组相比：#0.01＜P＜0.05，##P＜0.01；n=3Fig.4 Effects of high glucose and / or NBAE on Nrf2, NQO1 and HO-1 levels in the glomerular endothelial cells. A, detection for level and localization of Nrf2 by immunofluorescence (scale bar, 20μm)； B, detection of Nrf2, NQO1 and HO-1 levels by Western blot, GAPDH was used as internal reference；C, statistical analysis of Nrf2, NQO1 and HO-1 levels； *0.01＜P＜0.05, compared with control group； #P＜0.05, ##P＜0.01, compared with HG group； n=3

讨 论

糖尿病肾病中，高血糖诱导的内皮细胞结构损伤和功能紊乱成为诱发糖尿病微血管并发症的首要步骤[10]，可以通过诱导血管内皮细胞活性氧生成增多，引起氧化应激，导致肾脏血管内皮细胞通透性增高[11]。抑制氧化应激，可以改善内皮细胞的功能。如热休克蛋白22（HSP22）通过减少线粒体活性氧产生抑制内皮细胞活化和血管病变从而保护人脐静脉内皮细胞（HUVECs）免受高糖诱导的损伤[12]。

香椿子具有多种药用价值，民间常用香椿子泡水或煎服，具有改善DN的功效。也有学者研究证实香椿子提取物可通过抑制氧化应激保护糖尿病肾脏[13]，我们进一步研究香椿子正丁醇提取物能否通过影响肾小球血管内皮细胞改善糖尿病病变程度。ROS容易对糖尿病血管内皮细胞特别是具有丰富毛细血管的器官造成不同程度的损伤。本研究中，我们发现高糖处理24 h后肾小球内皮细胞ROS水平升高，使用NBAE处理后ROS水平明显降低。P47phox是NADPH氧化酶的一个催化亚单位，主要位于胞质内，一旦激活就会易位到胞膜上[14]，从而使NADPH氧化酶激活，诱导过氧化物生成，因而是氧化应激的一种标志物。有研究报道，NADPH氧化酶亚基p47phox亦可通过增加其表达量来上调NADPH氧化酶活性，如，葫芦巴丸可抑制糖尿病大鼠体内NADPH氧化酶上游调控因子C-α蛋白激酶(PKC-α) 与NADPH 氧化酶亚单位p47phox蛋白及mRNA的表达，降低肾脏组织NOX活性, 并减轻对肾脏组织的氧化应激损伤[15]。黄芪汤能够有效降低NADPH氧化酶水平及其亚基p47phox、p67phox、p40phox等的表达，以降低ROS的表达，改善同型半胱氨酸（Hcy）诱导的内皮功能障碍[16]。本研究发现高糖刺激24h后p47phox在胞质荧光强度明显提高，且荧光增强主要位于细胞一侧，连同局部胞膜表达量增高，分析原因可能是：原位于胞质低表达的p47phox经高糖刺激后，表达量增高并在细胞内聚集然后向胞膜转移，故有局部表达增高，至于在细胞一侧的聚集原因还需要进一步的研究。本研究还观察到NBAE可降低高糖引起的p47phox在胞质的高表达。一氧化氮（NO）是最重要的内皮细胞释放的血管舒缩因子之一，具有松弛血管平滑肌、舒张血管、预防凝血及血小板聚集等作用。NO在组织中的合成和降解维持一种动态平衡，ROS可迅速灭活NO，正常生理条件下，NO合成与ROS降解之间维持动态平衡，在高糖刺激时，产生大量ROS，可以破坏动态平衡，造成NO迅速减少。本研究结果亦证实，高糖刺激后肾小球血管内皮细胞NO水平明显降低，而NBAE可部分恢复NO的水平。以上结果表明高糖刺激肾小球内皮细胞后引起氧化应激，NBAE可以多方面改善高糖引起的肾小球内皮细胞氧化应激，发挥保护内皮细胞的作用。

Nrf2是一种转录因子，在氧化应激损伤中通过上调下游抗氧化酶，如NQO1、HO-1等发挥调节保护作用。青藤碱通过激活Nrf2，然后抑制RhoA/ROCK信号通路，减少ROS生成，从而改善高糖引起的肾小球血管内皮细胞功能障碍[11]。高糖刺激人脐静脉内皮细胞，桂皮醛通过激活Nrf2抑制ROS生成，维持NO水平保护内皮细胞，如果干扰Nrf2上述反应消失[17]。这些研究表明激活Nrf2信号通路以减少氧化应激是保护组织细胞的重要途径。为了明确NBAE是否能通过激活Nrf2通路来实现对肾小球血管内皮细胞的抗氧化作用，本研究继而检测了Nrf2的表达情况，Western blot结果表明，高糖处理组Nrf2表达下降，给与NBAE处理后， Nrf2表达水平明显升高，核易位明显增多，其下游蛋白NQO1和HO-1的表达亦明显增多。以上结果表明，NBAE可能通过激活Nrf2通路以改善高糖引起的肾小球内皮细胞氧化应激。

综上所述，本研究表明NBAE可改善高糖诱导的肾小球内皮细胞的氧化应激，推测可能通过激活Nrf2信号通路减少ROS的生成、抑制NADPH氧化酶激活、维持NO水平等方面来实现。本文为探索香椿子正丁醇提取物改善糖尿病肾病提供了一定的理论基础。