UCF-101对阿霉素致小鼠心肌酶学、氧化应激改变和细胞凋亡的影响

刘欣菲 马红梅

阿霉素为蒽环类抗生素，是临床上广泛使用的抗肿瘤药物，主要适用于白血病、乳腺癌、淋巴瘤和肺癌等恶性肿瘤，疗效显著[1,2]。心脏毒性作用是阿霉素的主要副反应之一，早期主要表现为心律不齐，如心动过速、QRS波群改变、非特异性ST-T改变和QT间期延长等，晚期则表现为扩张性心肌病和充血性心力衰竭[3,4]。因此，寻找有效的防治措施，对于改善患者预后和扩大阿霉素的临床应用意义深远。

位于线粒体的丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2是胞内线粒体凋亡途径中重要的信号分子[5]，其特异抑制剂UCF-101对调控心肌细胞、肾小管上皮细胞及神经元的氧化应激和凋亡等发挥着重要作用[6,7]。但目前尚不清楚UCF-101是否可以影响阿霉素介导的氧化应激和心肌细胞凋亡等，从而保护心肌功能。因此，本研究通过复制阿霉素致小鼠心脏毒性模型，观察UCF-101对模型小鼠是否有心脏保护作用，为其临床治疗提供初步依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂和药品

60只SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重25-30g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于武汉大学人民医院动物房(22-24℃)，自由摄食、饮水。乳酸脱氢酶(LDH，批号：C0016)、肌酸激酶同工酶(CK-MB，批号：H197)、丙二醛(MDA，批号：S0131)、超氧化物歧化酶(SOD，批号：S0103)和活性氧(ROS，批号：S0116)检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所(中国)。TUNEL试剂盒(批号：11684817910)购自Roche公司(德国)。阿霉素(批号：D1515)和UCF-101(UCF，批号：SML1105)均购自Sigam公司(美国)。

1.2 实验分组及其处理

实验小鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为4组，即空白对照组、UCF对照组、阿霉素模型组和阿霉素+UCF组，每组各15只。其中阿霉素模型组和阿霉素+UCF组小鼠一次性腹腔注射阿霉素15mg/kg复制阿霉素致心脏毒性模型[8]，两组小鼠均成模。空白对照组和UCF对照组小鼠一次性腹腔注射等量生理盐水。之后，UCF对照组和阿霉素+UCF组小鼠分别每日腹腔注射UCF-101 1.5μmol/kg[8]，连续5天；空白对照组和阿霉素模型组则每日腹腔注射等量生理盐水。

1.3 超声心动图检测心功能

于实验第6天称取小鼠体重后检测心脏功能。各组小鼠经1%戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg)麻醉后固定在超声操作台上，采用Visual Sonics公司的小动物超声仪(型号：Vevo770，加拿大)，选取标准左心室短轴切面，测量并记录左心室射血分数(EF)及左心室短轴缩短率(FS)等心功能指标。

1.4 血样、心肌组织标本采集、处理和分配

超声检测结束后取尾静脉血液，每组成功获取10只小鼠血样，高速离心机(型号：Sorvall ST8，ThermoFisher Scientific公司)3 000g离心15min，收集血清直接测定酶学指标LDH和CK-MB。颈椎脱臼法处死各组小鼠，取出心脏，挤出心脏残血并称取心脏质量。每组10只小鼠心脏研磨成组织匀浆，BCA法测量总蛋白浓度后分别各5只用于测定心肌酶学指标LDH、CK-MB和心肌氧化应激指标SOD、MDA和ROS水平；每组另5只小鼠心脏用4%中性福尔马林固定后进行心肌细胞凋亡水平测定。

1.5 血清和心肌酶学指标、心肌氧化应激指标测定

血清和组织匀浆酶学指标以及组织匀浆氧化应激指标测定均采用ELISA，酶标仪(型号：VarioskanFlash3001)购自ThermoFisher Scientific公司，操作步骤严格按照各指标试剂盒说明书测定。

1.6 心肌细胞凋亡率测定

心肌组织经固定、脱水、石蜡包埋后切片，滴加蛋白酶K进行抗原修复。将1μl末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、1μl DIG-dUTP和18μl标记缓冲液混匀后滴加于样品玻片，室温孵育2h。封闭后滴加一抗，室温孵育2h，清洗后滴加二抗，避光孵育30min，每玻片加入50μl BCIP/NBT，孵育30min后漂洗，中性树脂封片，显微镜下观察。TUNEL阳性细胞呈棕褐色，高倍镜(×400)下计数10个视野下细胞总数和TUNEL阳性细胞数，取均值进行统计学分析。心肌细胞凋亡率=(阳性细胞/细胞总数)×100%。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组体重、心重和心功能指标比较

各组间体重、心重、EF和FS差异均有统计学意义(P<0.01)；两对照组比较，各指标差异均无统计学意义(t=0.15、0.44、0.90和0.78，P>0.05)；阿霉素模型组各指标明显低于空白对照组，差异有统计学意义(t=9.09、6.52、15.52和18.13,P<0.01)；阿霉素+UCF组小鼠各指标显著高于阿霉素模型组(t=4.99、3.62、20.51和5.25，P<0.01)。见表1。

表1 各组小鼠体重、心重和心功能指标比较均=15)

注：与空白对照组比较，1)P<0.01；与阿霉素模型组比较，2)P<0.01

2.2 各组血清和心肌组织酶学指标比较

各组间血清和心肌组织LDH和CK-MB水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。两对照组比较，血清和心肌LDH和CK-MB水平差异均无统计学意义(t=0.63、2.06、1.58和0.89，P>0.05)；阿霉素模型组血清和心肌组织LDH和CK-MB水平均明显高于空白对照组(t=52.02、18.31、23.57和14.96，P<0.01)；阿霉素+UCF组小鼠血清和心肌LDH和CK-MB水平均明显低于阿霉素模型组(t=33.60、15.04、11.18和5.38，P<0.01)。见表2。

表2 各组小鼠血清和心肌酶学指标比较

注：与空白对照组比较，1)P<0.01；与阿霉素模型组比较，2)P<0.01

2.3 各组心肌氧化应激指标比较

各组间心肌组织SOD、MDA和ROS水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。两对照组比较，以上指标无明显差异(t=1.549、1.000和1.150，P>0.05)；阿霉素模型组SOD水平明显低于空白对照组，MDA和ROS水平明显高于空白对照组(t=17.58、25.43和11.17，P<0.01)；阿霉素+UCF组SOD水平较阿霉素模型组显著升高，MDA和ROS水平较阿霉素模型组显著降低(t=10.55、17.99和9.164，P<0.01)。见表3。

表3 各组小鼠心肌组织氧化应激水平比较

注：与空白对照组比较，1)P<0.01；与阿霉素模型组比较，2)P<0.01

2.4 各组心肌细胞凋亡率比较

各组间心肌细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。两对照组心肌细胞凋亡率比较无明显差异(t=2.00，P>0.05)。阿霉素模型组凋亡率明显高于空白对照组(t=28.86，P<0.01)；阿霉素+UCF组凋亡率明显低于阿霉素模型组(t=17.94，P<0.01)。见图1和表4。

表4 各组小鼠心肌细胞凋亡率均=5)

注：与空白对照组比较，1)P<0.01；与阿霉素模型组比较，2)P<0.01

注：阿霉素模型组凋亡细胞(棕褐色)多于对照组，而阿霉素+UCF组凋亡细胞则较阿霉素模型组明显减少

图1 各组小鼠心肌细胞凋亡水平(×400)

3 讨 论

既往研究表明，当阿霉素累积量从400mg/m2到超过700mg/m2时，心力衰竭的发生率从5%上升为48%[9]，但此心脏毒性的具体机制尚未全面明确。目前较公知公认的机制为脂质过氧化和线粒体功能损伤，认为阿霉素进入心肌细胞后，可被线粒体细胞色素P450还原酶和NADPH氧化还原酶还原为半醌自由基，直接作用于心肌细胞，引起线粒体和DNA损伤[10，12]。而且半醌自由基还可将电子传递给氧和水，产生大量ROS，引起细胞膜脂质和蛋白过氧化，最终导致心肌细胞凋亡[13，14]。因而从阿霉素致病机制中寻找抵抗或改善其毒性作用的靶点，如Omi/HtrA2等，成为临床关注的重点。

UCF-101是特异性的Omi/HtrA2抑制剂，可通过抑制Omi/HtrA2活性和胞内氧化应激水平，调控心肌细胞、肾小管上皮细胞和神经元细胞等的凋亡过程[15]。相关研究表明，UCF-101可通过抑制Omi/HtrA2活性，降低心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡[16]，以及 UCF-101可通过降低胞内氧化应激水平，改善脓毒症大鼠脑氧化损伤和认知反应[9]。但有关UCF-101能否针对Omi/HtrA2靶点改善阿霉素介导的心肌氧化应激损伤和细胞凋亡，保护心功能的报道甚少。

本实验通过建立小鼠阿霉素致心脏毒性模型，观察UCF-101在阿霉素致心脏毒性中的作用。结果显示阿霉素模型组小鼠体重、心重和心功能指标EF、FS均明显降低，心功能受损。UCF-101连续干预5天可显著改善模型小鼠心脏状况和心功能，继续观察心肌酶学指标LDH、CK-MB和氧化应激指标SOD、MDA和ROS以及心肌细胞凋亡率，均发现UCF-101干预可以显著降低LDH、CK-MB水平，显著降低MDA、ROS活性和心肌细胞凋亡率，提升SOD水平，实现改善心脏损伤、改善心功能的目标。其作用主要由于SOD作为体内重要抗氧化剂，可以清除过多ROS和MDA，使由半醌自由基与氧结合形成的ROS及其对心肌细胞膜完整性的破坏减少，使脂质过氧化过程中产生的醛类物质MDA减少，加上酶促反应水平的降低，从而有效下调胞内氧化应激水平，有效保护心肌细胞凋亡，极大地改善心脏功能。

总之，UCF-101能有效缓解阿霉素诱导的氧化应激和细胞凋亡，改善心脏功能，发挥心脏保护作用，为以线粒体蛋白酶Omi/HtrA2作为靶点防治阿霉素致心脏毒性提供了新思路。