复方樟柳碱对大鼠缺血微动脉血流灌注和自律运动的影响*

张 坚 杨明峰 刘明明 李 媛 孙保亮, #

樟柳碱是从茄科植物唐古特山莨菪根中提取的一种生物碱，为胆碱能神经阻滞剂，具有缓解平滑肌痉挛的抗胆碱作用，现已实现化学合成，其对恢复微循环灌注、改善局部组织缺血、提升微血管活性、缓解微血管痉挛、保护和稳定微血管内皮细胞等方面的功效明确[1]。复方樟柳碱(Compound Anisodine，CA)为氢溴酸樟柳碱(703)和普鲁卡因(PHI)的复合制剂，可改善多种原因所致的视网膜、脉络膜和视神经部位的微循环血液灌注障碍，有助于治疗青光眼视神经病变、视网膜动静脉阻塞和视神经挫伤等疾病，已广泛应用于治疗缺血性眼病，其功效机理以改善缺血组织微循环血流灌注为基础[2-4]，达到比单纯扩血管药物更佳的疗效[5]，但改善血流灌注的作用机制尚未阐明。

微血管自律运动是微血管持续呈现的自主节律性收缩与舒张，并由此引起局部微循环血流灌注的节律性波动，有助于促进微循环灌注效率、促进物质交换与代谢，具有重要生理意义[6-9]。组织缺血初期微血管自律运动激活可代偿性增加组织微循环灌注能力[10]，若缺血状态持续，自律运动会受到抑制，组织缺血可能进一步加重。应用莨菪类药物可以激活微血管自律运动，改善组织微循环血流灌注状态[11]。因此，激活微血管自律运动对加强组织微循环血流灌注、改善组织缺血状态意义显著。本研究通过活体动物微动脉反应性实验模型，探讨CA及其组分703(0.01%)和PHI(0.1%)对大鼠小肠壁微动脉血流灌注和自律运动的影响，为CA临床作用机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

SPF级雄性SD大鼠，体质量233.2±19.2g，共66只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXX [京] 2012-0001，批号：1140070094792)。经1周适应性喂养，按实验时所用药物，采用随机数字表法分为CA组、703组和PHI组，每组18只，余12只用作生理盐水(NS)对照组(NS组)。各组大鼠饲养于12h明暗交替环境，温度22-23℃，湿度40%- 60%，自由饮水摄食。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1试剂：重酒石酸去甲肾上腺素(NE)注射液购自上海禾丰制药有限公司(规格2mg/ml，批号：131003)，配制应用浓度为0.02%；CA注射液购自北京紫竹药业有限公司(规格2ml，含703 0.2mg、pHI 20mg，批号：14130906)，应用浓度为注射液原液；703粉剂购自北京紫竹药业有限公司(批号：1420140303)，配制应用浓度为0.01%；PHI注射液购自东亚制药有限公司(规格0.1ml，浓度1%，批号：2014091761)，配制应用浓度为0.1%；NS购自山东齐都药业有限公司，使用浓度为0.9%。所有试剂配制均使用双蒸水。

1.2.2仪器：Nikon体视显微镜(AZ100型，日本Nikon公司)；三维可调节光纤冷光源照明装置(C-FLED2型，日本Nikon公司)；激光多普勒微循环血流仪(LDF PF5000型，光纤探头200μm，瑞典Perimed公司)；自动微量注射泵(KDS-100-CE型，美国KD Scientific公司)；PVC输液管(200μm)与光纤探头组合为一体，安装于三维可调节夹持装置，确保滴液定位准确；自制小肠保湿恒温装置。

1.3 大鼠小肠壁微动脉显微观测方法

各组大鼠经3 %戊巴比妥钠麻醉后，于下腹部中线右侧切口，暴露小肠段，置于保湿恒温实验装置内，在体视显微镜下通过三维调节夹持装置将LDF光纤探头和PVC输液管组合垂直定位于小肠外壁单支微动脉(平均管径95±21μm)，保证给药、检测的精准定位控制。

所有药物通过输液泵滴加单支微动脉，滴加量均为0.1ml，药物影响范围≤5mm2。先行滴加NE 0.1ml致微动脉完全收缩，随后立即滴加各种干预药物。连续记录NE前、各种药物干预后即刻至15min的微动脉血流灌注和自律运动数据曲线，选择读取NE前、药后即刻、1min、5min、10min、15min 6个时点数据进行统计学分析。

1.4 检测指标

将各组NE前平稳时10s血流量均值设为均一化基准值，观察记录各组各时点微动脉血流灌注和自律运动的变化水平。其中血流灌注指标包括血流灌注水平(BP)、相对血流灌注水平[RBP=(药后不同时点BP/NE前BP基准值)×100]；自律运动指标包括药后自律运动起始时间(Vt)，应用快速傅里叶变换法(FFT)[12]计算药后15min内微动脉自律运动频率(VF)和振幅(VA)。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠微动脉RBP比较

应用NE预收缩前，各组BP的基线值未见明显差别(P>0.05)；滴加NE后，各组微动脉血流均停滞。局部滴加不同实验药物后不同时间，各组BP开始不同程度恢复，如图1所示。据此计算分析各组药后RBP时效，结果表明药后即刻、1min、5min、15min的RBP水平经方差分析有显著性差异(均P<0.05)，各组药后10min的RBP无统计学意义(P>0.05)。两两比较，药后即刻RBP以703组最高，与NS组接近(P>0.05)，PHI组最低；药后1min和5min的RBP以CA组最高，几近NE前水平(P>0.05)，显著高于其它三组(均P<0.01)，PHI组次之，也明显高于703组和NS组(均P<0.01)；药后15min的RBP仍以CA组最高，与其它三组有显著差异(均P<0.05)，703组次之，PHI组最低。见表1和图2。

2.2 各组大鼠微血管自律运动指标比较

应用NE可致微动脉预收缩，造成局部微循环停滞，但伴行的微静脉未见同步收缩反应。给予实验药物干预，在微血流恢复中，药物作用可诱发检测点原位或其上游微动脉出现不同程度的自律运动，引起检测点微血流灌注量节律性波动。

图1 各组大鼠微动脉药物干预前后BP变化曲线

组 别nNE前药后即刻药后1min药后5min药后10min药后15minNS组12100.00±0.0017.37±5.1617.37±4.2426.37±10.5664.64±28.5078.80±24.89CA组18100.00±0.0015.15±3.711)71.89±20.632)96.60±19.672)85.36±22.4191.50±18.541)703组18100.00±0.0018.33±5.253)21.74±6.653)24.95±7.843)82.02±19.9283.65±21.153)PHI组18100.00±0.0011.23±2.104)44.15±18.214)78.34±19.814)76.02±20.3565.97±23.844)F值8.8937.7061.571.573.32

注：与703组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与PHI组比较，3)P<0.01；与NS组比较，4)P<0.01

图2 各组大鼠微动脉药物干预前后RBP的时效曲线

如表2所示，各组间数据方差分析VF无统计学差异(P>0.05)，Vt和VA具有统计学意义(均P<0.05)。两两比较703组Vt出现最早，CA组次之，均明显早于PHI组和NS组(P<0.05或P<0.01)；CA组VA显著高于其它三组(P<0.01)，PHI组大于703组和NS组(均P<0.01)，703组与NS组差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组微动脉自律运动指标比较

注：与703组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与PHI组比较，3)P<0.01；与NS组比较，4)P<0.01

3 讨 论

既往研究表明，山莨菪碱能够激活微血管自律运动[11]，改善组织血流灌注。本研究显示，CA可使大鼠微动脉相对血流灌注水平回升至NE前，明显强于其组分703和PHI的单独作用。提示CA对于NE所致微动脉收缩，有快速扩张微动脉恢复血流灌注的功效。

微血管自律运动是微循环血流灌注调控的动态模式，由小动脉、微动脉和毛细血管前括约肌等的自主节律性舒缩，并引起组织微循环血流及压力的节律性波动而成，可使毛细血管床血液充盈和排空呈现交替变化[7]，有助于提高组织血流灌注水平，促进微循环物质交换和氧代谢[7, 13, 14]。自律运动根据其频率和振幅可分为三种基本有效模式，即低频高幅、高频高幅、高频低幅，其中低频高幅模式能效最大、持久性最强，对血流灌注和物质交换贡献最显著[15, 16]，而低频低幅模式属于无效噪音模式。本文显示，VF各组间无显著差异，均为低频模式；CA组Vt较早，VA最高，符合低频高幅模式的微血管自律运动，可快速激活微动脉，快速提升微循环血流灌注水平；703组的Vt虽早于CA组，但其VA很低，相对CA组，可认为其微血管自律运动的表现为低幅模式，对改善血流灌注贡献明显不如CA；PHI组Vt较慢，VA虽相对较高，但明显低于CA组，有较强的扩血管、增血流效果，但无法形成稳定高效的微血管自律运动，因此改善组织微循环灌注的能力有限；NS组为低频低幅模式，且Vt也晚，故对血流灌注的改善几乎无作用。说明CA可发挥703和PHI的协同作用，激活微血管自律运动低频高幅模式，产生高效改善组织缺血的效果，充分体现了CA的优越性。

微血管自律运动受神经体液调节，与组织代谢状态和组织血氧变化密切相关[17, 18]。自律运动的波浪样节奏，较稳态血流更能显著提高毛细血管床的血流灌注和跨血管壁物质交换的效率，增强组织氧代谢和氧扩散距离以及促进氧浓度均匀分布，这种特殊的血流动能还有助于防止血栓形成、减少白细胞贴壁，改善微循环血流状态、缓解局部血流瘀滞[19, 20]，解除血管痉挛，改善血液黏稠度[5]，从而更有效提升血流动能和灌注效率。

综上，CA能明显改善NE致大鼠肠壁微动脉缺血，干预机理在于其激活了微动脉自律运动的低频高幅模式。CA的组方配伍，在发挥PHI解痉和扩血管作用的同时，利用703激活微血管自律运动功效，协同改善组织血流灌注和微循环功能。本研究为全面阐明临床实践中CA的治疗作用提供了初步实验依据。