蔡 萍,何 丹,陈 林,梁雪娟,唐纯玉,张水寒,黄惠勇
(1.湖南省中医药研究院中药研究所,湖南长沙410013;2.湖南省中医药大学,湖南长沙410208;3.湖南时代阳光药业股份有限公司,湖南永州425000;4.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心,湖南长沙410208)
2015版《中国药典》收载的药用百合为百合科植物卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)、百合(Lilium browniiF.E.Brown var.viridulumBaker)或细叶百合(LiliumpumilumDC.)的干燥肉质鳞叶[1]。百合最早收录于《神农本草经》,是药食两用之品。生百合及蜜百合为临床常用饮片,炼蜜有“补脾气,润肺燥”之功,故蜜炙后百合润肺止咳的作用增强,多用于肺虚久咳、肺痨咳血等症,是辅料与药物的协同作用所致。
高效液相(HPLC)指纹图谱强调对样品组成的系统表征及稳定性组分的鉴定及评估,被广泛用于中药质量控制研究[2-3]。但单一的指纹图谱无法明确样品间差异来源,在精确筛选质量控制的指标性成分方面存在缺陷。化学计量学方法,如相似性分析(SA)、主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)等已经被世界卫生组织(WHO)[4]及其他部门[5]引入,并接受用于复杂多分量系统的定性分析和质量控制[6-9]。本研究收集23批不同来源的生百合及蜜炙品,建立百合蜜炙前后的HPLC指纹图谱;利用中药相似性分析软件,找到两类百合的共有峰;应用随机森林算法对指纹进行分类识别,为百合的质量控制和指标成分的选择提供依据,为全面控制百合质量提供参考。
Agilent1200高效液相色谱仪,包括二极管阵列检测器、自动脱气机、四元泵、自动进样器,柱温箱;KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);布氏漏斗。
乙腈、甲醇(色谱纯,德国Merck公司);H3PO4(分析纯,湖南汇虹试剂有限公司);无水乙醇(分析纯,湖南汇虹试剂有限公司);纯净水(华润怡宝饮料有限公司)。
本研究通过购买和到主产区采集方式,获得了23份蜜炙百合与生百合样本,并经湖南省中医药研究所刘浩助理研究员鉴定为百合科植物卷丹(Lilium lancifoliumThunb.)的干燥肉质鳞叶,样品包括13批蜜炙百合:S1(豪州市贡药饮片厂)、S2(安徽大别山)、S3(湖南衡阳)、S4(湖南龙山石牌镇)、S5(湖南龙山冼洛乡)、S6(安徽毫药千草国药股份有限公司)、S7(湖南隆回县北山乡)、S8(亳州华云饮片有限公司)、S9(河北祁新中药颗粒饮片有限公司)、S10(保定商宇药业有限公司)、S11(湖南龙山县茅坪乡干坝村)、S12(保定商宇药业有限公司)、S13(湖南白羊乡);以及10批生品百合:S14(豪州市贡药饮片厂)、S15(湖南衡阳)、S16(湖南邵东县界岭)、S17(湖南龙山石牌镇)、S18(云南湾塘乡)、S19(湖南龙山冼洛乡)、S20(亳州华云饮片有限公司)、S21(湖南龙山县石牌镇红桥村)、S22(湖南龙山县三元乡青岗村)、S23(湖南省龙山县桶车乡)。
1.3.1 供试品溶液的制备 取百合样品粉末(过40目标准检验筛)约4.0g,精密称定,加入80%甲醇溶液50mL,静置20min,超声30min,过滤,滤液经0.22μm微孔滤膜滤过,制得供试品溶液。
1.3.2 色谱条件 色谱柱:Eclipse Plus C18柱(250×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.3%H3PO4溶液(B),梯度洗脱:0~5min,5%~8%A;5~7min,8%A;7~18min,8%~16%A;18~20min,16%A;20~25min,16%~18%A;25~28min,18%~20%A;28~38min,20%A;38~43min,20%~24%A;43~50min,24%A。流速:1.0mL/min;柱温:25℃;进样体积:20μL。检测波长:250nm。
1.3.3 质谱条件 电喷雾电离(ESI);检测方式:负离子模式;干燥气温度325℃;干燥气体积流量11.0 L/min;鞘气温度350℃;毛细管电压4.0V。负离子模式获得电喷雾电离质谱图,全扫描质谱范围m/z100~1 000。
1.4.1 精密度实验 取湖南龙山冼洛乡蜜百合供试品溶液(样品5),按优化色谱条件连续进样6次,记录指纹图谱。以6号峰为参照峰计算各峰相对保留时间和相对峰面积的精密度,其相对标准偏差(RSD)值均小于3,符合指纹图谱技术要求,表明仪器等整个检测系统精密度高。
1.4.2 重复性实验 平行制备6份供试品溶液,按“1.3.2”色谱条件进行分析。计算各峰相对保留时间和相对峰面积考察方法重复性,其RSD均小于3%,说明方法重现性良好。
1.4.3 稳定性实验 取同一供试品溶液(样品5),按优化色谱条件,分别在0、6、12、24、48h检测指纹图谱。计算各峰相对保留时间和相对峰面积,其RSD值均小于3%,表明样品在48h内稳定性良好。
经《中药色谱指纹图谱相似度评价(2004药典版)》软件分析百合HPLC指纹图谱数据,确定共有峰,生成对照图谱并进行相似度评价。以共有峰面积为变量,将各批次样品数据导入Matlab软件,采用随机森林算法来分析研究不同来源蜜炙百合和生百合的差异,筛选导致样品间差异的化学成分。
考察了80%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇等不同提取溶剂对提取效率的影响。结果显示,以80%甲醇作为提取溶剂获得的成分最丰富,含量相对较高。
使用二极管阵列检测器在200~400nm波长范围对样品进行扫描,分析比较各波长下色谱图。结果显示,250nm下检测到各成分相对较好,分离度良好,峰数目最多,基线平稳,特征峰明显且峰形较好,能最大程度的反映样品信息。其次对水相(0.3%甲酸水溶液和0.3%H3PO4水溶液)进行考察,结果表明流动相pH值对百合酚酸糖苷类类化合物色谱峰的分离有一定影响,0.3%H3PO4水溶液作为水相可获得更好的分离效果。
将23批生百合和蜜百合按优化色谱条件分别进样,得到各样品的HPLC色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价(2004药典版)》软件分析,选择分离度好且出峰数多的18号样品作为参照谱图,时间宽度0.5,中位数为相关系数对样品进行自动匹配,得到生百合和蜜百合不同来源指纹图谱分析,见图1。
图1 23批百合的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint of 23batches of Lilium
23批蜜百合和生百合共提取到13个共有峰,生成对照指纹图谱(图2)。按照优化质谱条件,采用负离子模式分析,对13个共有峰进行分析鉴定,根据其质谱信息和裂解规律,参考文献报道共解析得到6个酚酸糖苷类成分,分别为王百合苷C(3号峰)、王百合苷A(5号峰)王百合苷D(6号峰)、王百合苷F(7号峰)王百合苷B(10号峰)和4-乙酰王百合苷D(11号峰)。质谱结果见图3。
图2 百合对照指纹图谱及共有峰Fig.2 Lilium control fingerprint and common peaks3.Regaloside C;5.Regaloside A;6.Regaloside D;7.Regaloside F;10.Regaloside B,11.4-Acetyl derivative of regalosid e D.
化合物3,tR=16.278min,m/z:415.1273[M-H]-,二级 扫 描 裂 解 产 生 m/z:253[M-H-C6H10O5]-,179[M-H-C9H16O7]-,161[M-H-C9H16O7-H2O]-,135[M-H-C9H16O7-CO2]-(图3),分子式为 C18H24O11,相对分子质量为415.1273,结合文献报道[10]鉴别化合物3为王百合苷C。
化合物5和化合物6的相对保留时间分别为:21.153min与24.198min,它们具有相同m/z:399[M-H]-,二级扫描裂解产生相同裂解碎片 m/z:237[M-H-C6H10O5]-、163[M-H-C9H16O7]-、145[M-H-C9H16O7-H2O]-、119[M-H-C9H16O7-CO2]-(图3),分子式为 C18H24O10,相对分子质量分别为:399.1317与399.1316,结合出峰先后及文献报道[11],鉴别化合物5和化合物6分别为王百合苷A、王百合苷D。
化合物7,tR=26.280min,m/z:429.1424[M-H]-,二级扫描裂解产生 m/z:429[M-H]-、267[M-H-C6H10O5]-、193[M-H-C9H16O7]-、175[M-H-C9H16O7-H2O]-、149[M-H-C9H16O7-CO2]-(图3),分子式为C19H26O11,相对分子质量为429.1424,结合文献报道[12],鉴别化合物7为王百合苷F。
化合物10和化合物11的相对保留时间分别为:36.929min与37.614min,它们具有相同的m/z:441[M-H]-,二 级 扫 描 裂 解 产 生 m/z:381[M-H-C2H2O-H2O]-、163[M-H-C11H18O8]-、145[M-H-C11H18O8-H2O]-、119[M-H-C11H18O8-CO2]-(图3),分子式为C20H26O11,结合出峰先后及文献报道[13],鉴别化合物10和化合物11分别为王百合苷B、4-乙酰王百合苷D。
图3 负离子模式下百合中5个成分的二级质谱图Fig.3 Mass spectra of 5species in Lilium in negative ion mode
利用23批样品中的13个共有峰及其峰面积,构建出23×13的数据矩阵,将得到的数据矩阵输入随机森林算法进行分类识别,用于判别生品和蜜炙百合间的差异。在构建分类识别模型的过程中,可得到样品间的相似性矩阵,并进一步利用多维特征尺度变换(MSD),将其映射到特征空间从中找到样品间的相互关系(相似或相近程度)(图4)。可见生品和蜜炙百合间存在较大的差异,并且在构建分类模型的过程中,可得到各共有峰对分类的贡献度,以贡献度的高低来判别各共有峰的重要性,见图5。从图5中可见,峰6(王百合苷D)和峰10(王百合苷B)具有最高的贡献度,为百合品类的鉴别提供了更加确切的依据。
图4 生百合与蜜百合分类图Fig.4 Classification map of candied Lilium and raw Lilium
图5 各变量的分类重要度Fig.5 Classification importance of each variable
本文利用高效液相色谱-飞行时间-串联质谱联用技术和模式识别方法,对不同来源的生百合与蜜百合样本进行分析,能有效区分生品与蜜炙的样品。本研究是对现有方法的有效补充,随机森林算法更加适合多类数据的分类分析,能为百合的质量评估提供新的方法和依据。