肟化衍生反应优化及其在聚糖分析中的应用

朱文杰，雷家珩，王华伟，林亚维＊

（1．武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北武汉430070；2．武汉市洪山区疾病预防控制中心，湖北武汉430060）

糖基化是蛋白质修饰的重要手段［1］，而修饰后的蛋白质参与到各项生命活动中，如细胞识别、细胞免疫、信息传递等［2］。糖基化的异常与很多疾病有关，如肿瘤、糖尿病、心血管病、肾病以及某些遗传性疾病等［2，3］。因此，针对糖蛋白上的聚糖进行分析，对疾病的诊断与治疗有着重要的意义。

目前，糖类物质常通过分离技术分离，包括：气相色谱法（GC）［4］、毛细管电泳法（CE）［5－6］和高效液相色谱法 （HPLC）［7－8］，并 与 合 适 的 检 测 技 术 联 用，包 括：紫 外 （UV）［9］、荧 光 （FLD）［10］、蒸 发 光 散 射（ELSD）［11－12］、脉冲安培（PAD）［13］、质谱（MS）［14］和核磁共振（NMR）［15］等。然而，由于糖类物质结构复杂、离子化效率较低，也不具备生色团，不利于进行光谱、质谱分析［16］。为了克服这一困难，在分析聚糖前，通常需要对聚糖进行衍生化处理。常用的方法有：还原胺化［17］、肼衍生［18］、迈克尔加成法［19］、泛甲基化［20］等。还原胺化是最常用的一种衍生方法，常用的衍生试剂有2－氨基苯甲酸（2－AA）、2－氨基苯甲酰胺（2－AB）等［7］。但还原胺化反应通常需要在无水的条件下进行，且反应后需要通过纯化除去大量的过量衍生试剂，耗时较长。肟化法是一种较为温和的标记方法，标记试剂上的氨基与羰基缩合形成肟式产物，在水溶液中可以稳定存在，常被用于聚糖修饰、药物开发、材料研发等［21］。4－氨氧基甲基－7－羟基－香豆素（AOHC）是一种商品化试剂，其具有一个7－羟基取代的香豆素母环，以及一个可与聚糖还原端反应的亚甲基氨氧基基团。由于香豆素母环具有很好的荧光性质与疏水性，氨氧基团对于聚糖有良好的反应活性，因此该试剂可用于聚糖的荧光标记以及质谱检测。

本文将AOHC用于聚糖的标记及检测。为了得到最佳的衍生效果，我们首先使用麦芽七糖（DP7）为模型聚糖，依次采用单因素变量法、响应面法对衍生反应条件进行优化，并且将优化后的AOHC衍生方法与传统的2－AB衍生方法作比较。最终，我们将建立的AOHC衍生化法用于糖蛋白RNase B中聚糖的基质辅助激光解吸电离－飞行时间质谱（MALDI－TOF MS）分析。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂与材料

LC－20AT高效液相色谱仪（日本，Shimadzu公司），附RF－20A荧光检测器；LS－55荧光分光光度计（美国，Perkin Elmer公司）；5800MALDI－TOF质谱仪（美国，AB SCIEX 公司）；PB－10pH 计（德国，Sartorius公司）。

4－氨氧基甲基－7－羟基－香豆素（AOHC）由本实验室自行合成；2，5－二羟基苯甲酸（DHB）、核糖核酸酶B（RNase B）（美国Sigma公司）；肽 N－糖酰胺酶F（PNGase F）（250U，美国 ThermoFisher公司）；10%壬基酚聚氧乙烯醚（NP－40）（美国Biolabs公司）；冰HAc（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；NH4Ac（分析纯，北京百灵威科技有限公司）；麦芽七糖（DP7）（纯度＞95%，北京百灵威科技有限公司），二甲基亚砜（DMSO）（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；苯胺（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）。纯水（经Milli－Q系统纯化）。

1．2 实验方法

1．2．1 AOHC与DP7衍生反应 在1mL离心管中，分别加入10μL AOHC（6．0mmol／L），10μL DP7（10μmol／L），10μL苯胺溶液（100mmol／L），10μL 0．2mol／L NH4Ac缓冲溶液（pH＝2．3），充分混合后，放入70℃恒温水浴锅中反应1h，加入60μL水稀释，待高效液相色谱－荧光法（HPLC－FLD）分析。色谱检测条件如下：ZORBAX Eclipse XDB－C18色谱柱（250×4．6mm，5μm，美国 Agilent公司）；流动相：10%乙腈水溶液；等度洗脱；流速：0．4mL／min；柱温：30℃；进样体积：20μL。激发波长：325nm，发射波长：475nm。

1．2．3 RNase B中聚糖AOHC衍生反应 （1）10μL RNase B加入90μL Na3PO4溶液，于100℃下加热10min，冷却后，加入12μL的10%的 NP－40，静置30min后，加入0．5μL PNGase F，37℃下反应24h后，煮沸5min，加入HAc，于37℃下静置30min后，用真空浓缩仪干燥。（2）将干燥后的样品溶于10μL水中，经由AOHC衍生后，用于 MALDI－TOF MS分析，AOHC衍生操作见1．2．1。

MALDI－TOF MS测试条件如下：基质为DHB；正离子模式；加速电压20kV；激光强度5 000；质量扫描范围为m／z500～3 000。

2 结果与讨论

2．1 4－氨氧基甲基－7－羟基－香豆素（AOHC）荧光性质分析

称取2．07mg AOHC，溶于1mL DMSO中，再用10%乙腈稀释至浓度2μmol／L，研究AOHC的荧光性质。结果如图1（A）所示，其激发波长、发射波长分别为325nm、475nm。以硫酸奎宁为参照，测得AOHC的荧光量子产率为0．63。

2．2 衍生产物的确定

利用HPLC－FLD对AOHC衍生DP7反应产物进行检测（图1（B）），在色谱图上观察到3个可能产物的色谱峰，保留时间分别为8．0min、12．1min和17．0min。对上述3个色谱峰依次进行质谱表征，结果均得到1 364．36Da［M＋Na］＋的衍生产物质谱峰（图1（C））。此结果表明，AOHC成功对DP7进行了标记。衍生反应产物存在3种异构体，包括两种开环的肟式结构和闭环的糖苷结构［15，22］。

2．3 衍生反应条件的单因素法优化

肟化反应是可逆反应，其反应速度及效率受反应条件的影响。本文探究了不同反应条件对肟化产物峰面积的影响。衍生试剂用量对衍生反应程度有着重要影响。随着AOHC浓度的增加，衍生产物峰面积随之增大，当AOHC浓度为6mmol／L时，衍生产物峰面积达到最大，选择6mmol／L AOHC。肟化反应通常需要质子催化，一般在酸性条件下进行，因此反应溶液的pH对衍生反应的速度及效率有着重要影响。本实验探究了不同pH下的衍生产物峰面积变化。随着pH值的增大，衍生产物峰面积先增大后减小，在pH值为3．5时达到最大值，单因素实验中选择反应pH值为3．5。升高反应温度，可以加快反应速度，本实验探究了不同温度下衍生产物峰面积的变化。当反应温度达到70℃后，衍生产物峰面积基本不再变化，实验中选择反应温度为70℃。据文献报道苯胺可用于催化肟化反应［23］。本实验探究了不同浓度苯胺对衍生效率的影响。随着苯胺浓度的增大，衍生产物峰面积先增大随后缓慢下降，本实验选择苯胺浓度为100mmol／L。衍生反应时间对衍生化程度有着重要影响，本实验探究了在加入催化剂后衍生产物峰面积随反应时间的变化。反应到达2h后，衍生产物峰面积不再增大，实验中选择反应时间为2h。

图1 （A）AOHC荧光光谱图；（B）AOHC衍生 DP7色谱图；（C）DP7－AOHC衍生产物质谱图Fig．1 （A）Fluorescence spectrum of AOHC；（B）Chromatogram of DP7after derivatization with AOHC；（C）Mass spectrum of DP7－AOHC derivative

2．4 衍生反应条件的响应面的优化

不同反应条件间存在着交互影响作用，为了达到最佳的衍生效果，我们在单因素实验结果的基础上，采用响应面法对衍生反应条件做进一步优化。选择AOHCl浓度为6mmol／L，苯胺浓度为100mmol／L，以反应温度（A，单位为℃）、反应时间（B，单位为h）、反应pH（C）为变量，以衍生产物峰面积为响应值，根据Box－Behnken中心组合实验设计原理，采用Design Expert 10响应面软件对衍生反应条件进行优化，进行3因素3水平实验，结果见表1。

表1 Box－Behnken中心组合设计方案及实验结果Table 1 Box－Behnken central composite design and the results of experiments

对实验结果进行方差分析，模型p＝0．0005＜0．05，表明模型中各影响因素对衍生产物峰面积影响显著；并且失拟项p＝0．0709＞0．05，失拟项相对于纯误差而言不显著。该模型的回归系数R2＝0．9528，说明该模型拟合程度良好，预测值与实测值之间有较好的相关性，实验误差小。应用响应面交互作用分析对3个因素A、B、C作两两交互作用分析，对其作响应面图（图2）。图2（A）、2（B）、2（C）分别表明了两种因素对衍生产物峰面积的的交互影响作用。

图2 三因素交互影响DP7－AOHC衍生产物峰面积的响应面图Fig．2 Respond surface 3Dplots of peak areas of DP7－AOHC derivative

经响应面模拟分析可得最佳衍生反应条件为：反应pH为2．3，反应温度为70℃，反应时间为1h。此条件下的衍生产物峰面积的理论值为1 491 601。为了验证响应面法的可靠性，采用上述最优条件进行衍生反应，测得衍生产物峰面积为1 522 476，与理论值相比，相对误差较小（2．07%）。利用响应面法得到的最优衍生条件可靠，因此可以直接用于样品的分析检测。

2．5 方法比较

在相同的DP7浓度下，分别用AOHC衍生化法和2－AB衍生化法对DP7进行衍生，对两种衍生方法测得的色谱峰面积进行比较，AOHC衍生DP7的衍生产物峰面积是2－AB衍生DP7的衍生产物峰面积的3．81倍。此结果表明，AOHC衍生具有很好的灵敏性。传统2－AB衍生化法需在无水条件下反应2h，且反应后需要通过纯化除去大量过量的标记试剂，而AOHC衍生化法则是在水溶液中反应1h，反应后无需纯化，可直接进行色谱、质谱分析。因此，AOHC衍生化法较传统的2－AB衍生化法具有明显的优势。

2．6 实际样品分析

将优化后的AOHC衍生化法用于衍生RNase B中的聚糖，利用MALDI－TOF MS进行检测分析，如图3所示，检测到RNase B中所有5种聚糖。此结果表明，AOHC衍生在生物样品中有着很好的应用。

图3 AOHC标记RNase B质谱图Fig．3 Mass spectrum of RNase B after AOHC labeling

3 结论

本文利用新型荧光衍生试剂4－氨氧基甲基－7－羟基－香豆素对聚糖进行衍生，发展了一种新的聚糖分析方法。本工作中我们分别采用响应面法和单因素法优化实验条件，建立的方法与传统的2－AB衍生化法相比，具有快速、灵敏、操作简便等优势。采用该方法，我们成功分析了糖蛋白RNase B中的聚糖，结果显示AOHC标记法在聚糖分析中有着很好的应用前景。