超高效液相色谱－串联质谱法同时测定生物体液中的酪氨酸及其代谢产物

梁先玉，李 斌，万益群＊，2

（1．南昌大学化学学院，江西南昌330031；2．南昌大学分析测试中心，江西南昌330047）

酪氨酸为芳香族氨基酸，它是构成人体蛋白质的重要氨基酸之一［1－2］，在生物体内会代谢出多种物质［3－4］，其代谢通路如图1所示［5］。研究表明，多种疾病的发生与酪氨酸代谢发生紊乱有一定的相关性［6－13］。因此，研究并构建生物体液中酪氨酸及其代谢产物的分析新技术，探讨酪氨酸及其代谢产物与癌症，特别是早期癌症的关联性具有重要意义。目前，酪氨酸及其多种代谢产物的检测方法主要有光谱法［14－15］、离子交换色谱法［16－17］、高效液相色谱法［18－21］、毛细管电泳法［22－23］和气相色 谱－质 谱法［24－25］等。这些方法各有其特点，如光谱法设备廉价、操作简单但选择性差，灵敏度也相对较低。生物体液基质较为复杂，因此，要实现低含量目标物的准确定量，必须选择性能更好的分离分析技术。超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC－MS／MS）选择性好、灵敏度高，在复杂基质中痕量组分的分析测定方面已得到广泛应用。

为了系统地探讨乳腺癌在发生发展过程中生物体液中酪氨酸及其代谢产物水平变化规律，本文应用UPLC－MS／MS联用技术，研究了酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、对 羟苯基乙 酸（4－Hydroxyphenylacetic Acid，PHPAA）、对羟苯基丙酸（3，4－Hydroxyphenylpropionic Acid，PHPA）、对羟苯基乳酸（4－Hydroxyphenyllactic Acid，PHPLA）、酪胺（4－Hydroxyphenylamine，HA）和多巴（3，4－Dihydroxyphenylalanine，DOPA）的色谱分离及质谱检测条件，构建了这些化合物同时分离分析新技术，并用于大鼠尿液分析，为后续研究酪氨酸及其代谢产物与乳腺癌的关联性奠定方法学基础。

图1 酪氨酸及其代谢产物代谢通路Fig．1 Metabolic pathway of tyrosine and its metabolites①Tyrosine decarboxylase（EC：4．1．1．25）；②Tyrosinase（EC：1．14．18．1）；③Tyrosine hydroxylase（EC：1．14．162）；④Tyrosine transaminase（EC：2．6．1．5）；⑤Hydroxyphenylpyruvate reductase（EC：1．1．1．237）；⑥4－Hydroxyphenyllactate dehydrogenase（EC：1．1．1．222）；⑦4－Hydroxyphenylpyruvate decarboxylase（EC：4．1．1．80）；⑧Aryl－aldehyde dehydrogenase（EC：1．2．1．29）．

1 实验部分

1．1 主要仪器与试剂

S30液相色谱仪（日本，岛津公司）；5600＋质谱仪（美国，AB公司），配有电喷雾（ESI）离子源；pHS－3C酸度计（上海雷磁仪表厂）。

标准品：酪氨酸（Tyr）（＞99%）、酪胺（HA）（＞97%）和对羟苯基丙酸（PHPA）（＞98%）购于美国 Acros Organics公司；对羟苯基乙酸（PHPAA）（＞98%）和多巴（DOPA）（＞97%）购于东京Chemical Industry公司；对羟苯基乳酸（PHPLA）（＞98%）购于美国Sigma－Aldrich公司。乙腈和甲醇（色谱纯）购于美国LiChrosolv公司；乙酸（色谱纯）购于TEDIA公司；乙酸铵（色谱纯）购于美国Anaqua Chemicals公司。实验用水（18．2MΩ·cm）取自于英国ELGA LabWater公司的PURELAB Option－Q纯水／超纯水系统。

1．2 标准溶液的配制

分别准确称取5．0mg的酪氨酸及其代谢产物标准品，置于10mL容量瓶中，用1%的甲酸溶解并定容，摇匀，配制成500mg／L的标准储备溶液，置于冰箱内4℃保存。使用时用pH＝5．7的HAc－NH4Ac缓冲溶液稀释至所需浓度。

1．3 色谱分析条件

色谱柱：Shim－pack GIST C18快速分离柱（75×2．1mm，2μm；SHIMADZU）；流动相：20mmol／L HAc－NH4Ac缓冲溶液（pH＝5．7）∶乙腈＝95∶5（V／V）；流速：0．2mL／min；自动进样器样品盘控温：4℃；柱温：室温；进样量：5μL；采样时间：正离子模式5min，负离子模式10min。

1．4 质谱条件

Eksigent 415（425）－Triple TOF 5600＋系统在多反应监测（MRM）模式中既可以正离子（＋）进行操作，也可以负离子（－）进行操作。各化合物的质谱分析参数见表1。

表1 Tyr、DOPA、PHPLA、PHPA、PHPAA和HA的质谱分析参数Table 1 Multiple reaction monitoring parameters for determination of Tyr，DOPA，PHPLA，PHPA，PHPAA and HA

1．5 样品采集及前处理

取5周龄SD级别的雌性大鼠（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），常规饲养，每周采集大鼠尿样。取一定量的尿样加入等体积超纯水，振荡摇匀，以12 000r／min离心10min。取上清液，过0．22μm水系滤膜后，进样分析测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱条件优化

本文主要探讨了以乙腈和HAc－NH4Ac缓冲溶液作为流动相，考察在不同浓度的缓冲溶液、不同pH值和不同有机相比例条件下，酪氨酸及其代谢产物的色谱分离情况。结果表明，当乙腈与20mmol／L HAc－NH4Ac缓冲溶液（pH＝5．7）体积比为5∶95时，酪氨酸及其代谢产物色谱峰的拖尾现象减少，峰形改善，分离效果最好，结果如图2所示。

2．2 质谱条件优化

在正、负离子两种模式下，分别对酪氨酸及其代谢产物标准溶液进行全扫描，扫描范围为m／z60～1 000，得到每种物质的分子离子峰。以该分子离子峰为母离子，在10～80V范围内，分别对其裂解电压进行优化，得到每个物质最佳母离子信号。然后，分别对每个物质进行二级质谱扫描，并优化其碰撞能。优化的质谱分析条件见表1。

2．3 样品前处理方法优化

大鼠尿液基质复杂，可能对待测物的分析造成较大干扰。为了保证分析结果的准确性，在进行测定之前，需要对大鼠尿液进行处理。实验取1mL尿液，分别加入3mL、2mL和1mL超纯水，以12 000r／min离心10min，取上清液过0．22μm水系滤膜后进样分析。结果表明，加入3mL和2mL超纯水，尿液中含量较低的酪氨酸代谢产物不易检出。因此，实验选择在尿液中加入1mL超纯水进行处理并检测。

图2 酪氨酸及其代谢产物的总离子流（TIC）色谱图Fig．2 TIC chromatograms of standard mixture solution of tyrosine and its metabolites（1）4－hydroxyphenethylamine；（2）tyrosine；（3）3，4－hydroxyphenylpropionic acid；（4）3，4－dihydroxyphenylalanine；（5）4－hydroxyphenyllactic acid；（6）4－hydroxyphenylacetic acid．

2．4 样品盘温度的优化

大鼠尿液基质复杂，样品盘温度对目标物的分析可能会有一定影响。实验对自动进样器样品盘温度进行了优化，发现尿液中酪氨酸及其5种代谢产物在不同样品盘温度下的响应信号变化情况不同。其中，酪氨酸、对羟苯基乳酸、对羟苯基乙酸、对羟苯基丙酸和酪胺随温度的变化其响应信号基本不变，而多巴则会发生变化。图3是样品盘温度对尿液中多巴含量测定的影响。实验结果显示，当样品盘温度大于4℃时，尿液中多巴的响应信号会发生较大改变。有研究表明，温度对尿液pH 值［26］、黏度［27］、肌酸含量［28］和尿蛋白与肌酐比［29］等都有一定影响。实验采用全扫模式对多巴标准品在不同样品盘测定温度条件下的稳定性进行了分析。结果显示，多巴标准品色谱峰面积随温度的变化不大，且未发现有新的物质生成，表明多巴标准品在不同温度下的稳定性较好。然而，对于尿液，当样品盘温度大于4℃时，由于其基质复杂，温度变化可能对尿液的性质产生了一定影响，进而可能对大鼠尿液中多巴的响应信号产生了抑制作用，从而导致多巴检测信号不稳定。当样品盘温度为4℃时，不会产生上述现象。因此，本实验选择样品盘温度为4℃。

图3 大鼠尿液中多巴在不同样品盘温度条件下的变化情况Fig．3 Changes of 3，4－dihydroxyphenylalanine in rat urine at different temperature of automatic samplera：4℃；b：6℃；c：15℃．

2．5 基质效应

基质效应会导致检测结果产生偏差［30－31］。本文用空白样品基质溶液配制成不同浓度的基质混合标准溶液（现配现用），制作基质匹配加标标准曲线。基质效应＝基质匹配加标标准曲线斜率／溶剂加标标准曲线斜率，斜率比越接近于1，基质效应越小［32－33］。实验结果表明（表2），基质效应对检测结果的影响较大。因此，实验采用基质加标标准曲线对待测大鼠尿液进行分析。

2．6 线性方程和检出限

用大鼠尿液将酪氨酸及其代谢产物的标准储备液配制成一系列不同浓度的混合基质标准工作溶液，在优化的条件下进行分析检测。采集各化合物色谱数据中的峰面积（A）与待测物的浓度（c）的数据，绘制基质标准曲线。结果表明，酪氨酸及其代谢产物的线性关系良好，检出限在0．0003～0．0041mg／L之间，线性范围和线性回归方程如表3所示。

表2 纯溶剂加标标准曲线与基质加标标准曲线之间的对比Table 2 The comparison between the standard curve of the analytes prepared in the pure solvent and in the matrix

表3 酪氨酸及其代谢产物的线性方程及检出限Table 3 Linear equations，correlation coefficients（R2），limits of detection（LODs）and limits of quntification（LOQs）for tyrosine and its metabolites

2．7 回收率与精密度

分别添加不同浓度水平的目标物至大鼠尿液中进行加标回收实验。在已优化的分离分析条件下进行检测，结果如表4所示。实验结果显示，酪氨酸及其代谢产物的回收率在82．0%～113．0%之间，相对标准偏差（RSD）小于4．4%。以上结果表明，该方法准确可靠，可用于大鼠尿液中酪氨酸及其代谢产物的分析检测。

表4 大鼠尿液中目标分析物的加标回收结果（n＝6）Table 4 Recovery of analytes in rat urine（n＝6）

2．8 样品分析

采用所建立的分析方法对大鼠尿液进行分析，结果如表5所示。由表5可知，大鼠尿液中共检测到酪氨酸、对羟苯基乳酸、对羟苯基乙酸和酪胺4种化合物，RSD小于3．9%，未检测到多巴和对羟苯基丙酸。这可能与多巴和对羟苯基丙酸在大鼠尿液中的含量较低有关。

表5 大鼠尿液中酪氨酸及其代谢产物的分析结果（n＝4）Table 5 Analytical results of tyrosine and its metabolites in rat urine（n＝4）

3 结论

本文研究构建了大鼠尿液中酪氨酸及其多种代谢产物同时分析测定的超高效液相色谱－串联质谱新方法。结果表明，该方法样品前处理简单，检测限在0．0003～0．0041mg／L之间，灵敏度较高；三个浓度水平的加标回收率在82．0%～113．0%之间，验证了所建立的方法的可行性。该方法可用于实际尿液分析，为进一步探讨酪氨酸及其代谢产物与某些疾病相关性提供了方法学参考。