高寒草甸优势禾草-异针茅内生真菌的分离与鉴定

鲍根生，俞永飞，李春杰

(1.省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海大学，青海 西宁 810003；2.青藏高原优良牧草种质资源研究重点实验室，青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016；3.兰州大学草地农业科技学院,草地农业教育部工程研究中心，甘肃 兰州 730020)

异针茅 (Stipaaliena) 隶属禾本科针茅属植物，是青藏高原高寒草甸植物群落的重要伴生禾草，主要分布在我国西藏东北部、青海高原、四川阿坝、甘肃南部等高海拔地区。异针茅是青藏高原地区重要的乡土草种之一，具有较强的耐旱、耐寒能力和耐牧性等特点；同时，茎叶柔软，适口性好，营养价值高，成为草食家畜主要可食的牧草之一[1]。

青海高原是青藏高原的重要组成部分，成为地球上最独特的地质-地理-生态单元，地理环境的特异性决定该区域分布植物种类的多样性和遗传特性的特异性[2]。青海高原的植物种群大多分布于荒漠草原和干旱草原地带，植物在极端环境条件下能顽强的生存，除与自身具有特有的遗传特性有关外[3-4]；同时，也与植物共生的细菌、真菌、丛枝菌根等微生物相关，共生微生物能提高植物对寒冷、干旱等极端环境的耐受能力[5-8]。孙海群[9]对青海高原禾本科植物资源调查发现，禾本科植物有55属，246种；同时，鲍根生等[10]对青海高原部分地区禾本科植物感染内生真菌现状调查发现，26种植物感染Epichloё属内生真菌。Epichloё内生真菌是指在宿主(冷季型禾草)体内度过全部或大部分生命周期，而宿主不出现外部症状的一大类真菌[11]；Leuchtmann等[12]根据内生真菌形态特征和扩增基因序列差异对现已报道的内生真菌重新命名为43种Epichloё属内生真菌。大量研究结果表明，Epichloё内生真菌与宿主间建立互利共生关系，主要表现在：一方面宿主为内生真菌提供生存空间并供给生长所需要的营养物质，另一方面内生真菌可以促进宿主植物生长、降低草食家畜对宿主的采食频次、提高宿主对非生物环境胁迫的耐受能力[13-15]。近年来，国内学者对中国境内禾草内生真菌分布和分类开展了大量研究。南志标[16]对西北部分地区22属48种禾本科植物种子中的内生真菌进行了检测，发现我国原产和国外引进的共7属13种禾本科草种中存在内生真菌。Wei等[17]对中国北方部分地区的禾本科植物内生真菌进行了调查，共检测了41种禾本科植物发现11属26种禾本科植物中含有内生真菌；鲍根生等[10]研究表明青海地区有12属27种禾本科植物感染Epichloё属内生真菌；同时，分别从醉马草(Achnatheruminebrians)、羽茅(Achnatherumsibiricum)、小颖羊茅(Festucaparvigluma)、拂子茅(Calamagrostisepigeios)、鹅观草(Roegneriakamoji)、草地早熟禾(Poapratensis)、鼠茅(Vulpiamyuros)、大雀麦(Bromusmagnus)和羊草(Leymuschinensis)中分离并鉴定出8个新种[18-25]，而且新的内生真菌资源不断被发现，说明我国存在丰富的内生真菌资源。

目前为止，采用形态学特征结合测序构建系统发育树的方法共鉴定43种禾草内生真菌[12]。其中，编码蛋白(tub)、转录延长因子(tef)、肌动蛋白(actin)基因序列分析被广泛应用于Epichloё属内生真菌的鉴定和系统发育关系推断[12]。例如，张晨炜等[26]发现犬草(Roegneriacanina)感染的内生真菌种类为Epichloёsinicum；旷宇等[27]对中国西北部8个地理种群的中华羊茅(Festucasinensis)感染的内生真菌分离，发现中华羊茅感染的内生真菌均为Epichloё属内生真菌；鲍根生等[28]研究表明紫花针茅(Stipapurpurea)感染的内生真菌分别为Epichloёchisosa、E.gansuensis和E.inebrians；Song等[29]研究发现中国西部9种披碱草属植物感染的内生真菌为Epichloёbromicola。Zhu等[20]发现羊草所携带Epichloё内生真菌鉴定为Epichloёbromicola。纪燕玲等[30]将苇状羊茅(Festucaarundinacea)所携带Epichloё内生真菌鉴定为Epichloёuncinatum。目前，针对异针茅的研究主要集中于种群补偿生长要素[31]、引种试验及草地群落方面的研究[1,32]，但有关异针茅内生真菌方面的研究较少，经检测发现青海高原地区异针茅内生真菌侵染率较高(≥80%)[10]。因此，本研究以青海高原地区两个地理种群中感染内生真菌的异针茅为研究对象，通过观察和分析异针茅形态学特征，确定异针茅感染的内生真菌是否符合Epichloё属内生真菌形态特征；利用tub、tef、actin基因序列构建系统发育树，明确异针茅感染内生真菌的分类地位，并结合形态学特征最终确定异针茅感染内生真菌的种类，为以后异针茅禾草内生真菌共生体在青藏高原特有微生物资源开发和利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2017年9月下旬在青海省玉树藏族自治州称多县和青海省海南州同德县同德牧场天然草地上采集异针茅植物样品，每个样点每隔100 m，随机采集10～20株异针茅单株，将地上部分放入编号的信封中带回实验室。

1.2 带菌率检测

异针茅内生真菌带菌率的检测采用种子苯胺蓝染色检测的方法，具体方法是：在室温条件下(15～22 ℃)，用5%氢氧化钠溶液将种子浸泡过夜。翌日，将浸泡后的种子用蒸馏水漂洗数次，将种子置于苯胺蓝溶液中静置1 h。将染色的种子置于载玻片上，在40倍目镜下观察内生真菌菌丝。如果种皮或糊粉层中出现光滑的深蓝色菌丝，确认异针茅被内生真菌所侵染。

1.3 内生真菌分离与培养

参照Song等[29]的方法进行异针茅植株感染内生真菌的分离，具体操作方法如下：每个单株挑选5粒种子并进行表面消毒，用无菌水冲洗3～5次后将种子置于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基上。真菌培养箱25 ℃黑暗环境中培养30 d，在种子表面形成菌落后，挑取少量菌丝体并在PDA培养基上培养。待产生分生孢子后，挑取单个分生孢子并在25 ℃黑暗环境中进行纯培养。每周测量菌落直径，4周后测量分生孢子和分生孢子梗大小。

1.4 内生真菌DNA的提取

用无菌刀片刮取菌丝体，加入少量石英砂研磨，将研磨后的粉末全部加入1.5 mL离心管中，根据真菌DNA提取试剂盒(HP Fungal DNA Kit(50)D3195-01)的说明书提取方法提取异针茅所感染的内生真菌DNA，并将提取的DNA进行凝胶电泳并储存在4 ℃的冰箱中备用。

1.5 利用tub、tef、actin三个管家基因确定异针茅内生真菌种类

在NCBI基因数据库Blast程序中搜索与异针茅tub、tef和actin序列直系同源性较高序列，挑选代表性序列并利用MEGA 6.0进行比对。将比对结果使用PAUP*4.0b 10软件构建系统发育树[33]。系统发育树选取以Claviceps purpurea(AF276508，AF276509和AF062646)作为外群的序列。

2 结果与分析

2.1 异针茅内生真菌形态特征

从玉树藏族自治州称多县和海南州同德县同德牧场两个异针茅地理种群分别挑选的10株单株内生真菌带菌率为81%和90%。同时，从20个单株中成功分离出3株内生真菌菌株；其中，玉树异针茅种群分离内生真菌编号为Yssa 5和Yssa 9，从同德异针茅地理种群分离内生真菌编号为Tdsa。25 ℃黑暗条件培养下，PDA培养基上菌落生长缓慢，平均生长速率为0.524 mm·周-1；其中，Yssa 5编号(图1A，B)的菌落正面气生菌丝分布稀疏，白色。边缘暗黄色蜡状环，反面黄色；Tdsa编号(图1D～E)菌落正面菌落白色，气生菌丝发达由中央向四周变稀疏，反面淡黄褐色，由中央向边缘变浅；Yssa 9编号(图1G～H)菌落正面气生菌丝稀疏，表面呈奶黄色，边缘有蜡质，中心凹起，反面暗褐色，边缘颜色变浅。分生孢子单生于分生孢子梗顶端，椭圆形、肾形、弯月形、梨形，3种编号的分生孢子平均大小为3.247 μm×6.628 μm；分生孢子梗基部单生或基部生成两个分支，平均长为26.669 μm，基部宽为2.721 μm，顶端宽为0.980 μm (图 1C、F、I)。以上特征均符合Epichloё属内生真菌特征。

图1 异针茅PDA菌落形态、分生孢子梗和分生孢子结构Fig.1 Photographs of hyphae, colony and conidial morphology isolated endophytes from S. aliena A～C: Yssa 5菌落正反面形态，分生孢子和分生孢子梗形态; D～F: Tdsa菌落正反面形态，分生孢子和分生孢子梗形态; G～I: Yssa 9菌落正反面形态，分生孢子和分生孢子梗形态。菌落大小标尺长度为10 mm，分生孢子和分生孢子梗大小标尺长度为20 μm。A-C: Morphology characteristics of colony, conidial isolated from Yssa 5； D-F: Morphology characteristics of colony and conidial isolated from Tdsa; G-I: Morphology characteristics of colony and conidial isolated from Yssa 9; Length of scale bar for colony pictures was 10 mm, and for conidia pictures was 20 μm.

2.2 系统发育分析

以异针茅分离内生真菌的总DNA为模板，利用tub、tef、actin3个管家基因为引物分别扩增目的片段基因。通过NCBI比对后，分别抽取60、60、59条禾草内生真菌tub、tef、actin序列。构建tub系统发育树的序列比对后长度为864 bp，其中包括365个保守位点、466个变异位点和250个简约位点；构建tef系统发育树的序列比对后长度为607 bp，其中包括226个保守位点、372个变异位点和209个简约位点；构建actin系统发育树的序列比对后长度为659 bp，其中包括305个保守位点、348个变异位点和193个简约位点。

tub、tef和actin序列构建的系统发育树显示(图2～4)，异针茅分离的菌株Tdsa与我国醉马草感染的E.gansuensis和E.inebrians明显聚成一条分支；而菌株Yssa 5和Yssa 9与分离于短柄草(Brachypodiumsylvaticum)感染的E.sylvatica聚到一起，自展值分别高达87%、99%和98%。

3 讨论

本研究发现两个地理种群的异针茅内生真菌的感染率高达80%以上，说明青海高原地区异针茅与内生真菌共生的现象比较普遍。同时，异针茅所感染的内生真菌种类出现差异，造成这种现象的原因可能为内生真菌对冷季型禾草侵染的概率较高，且禾本科植物内生真菌与冷季型禾草形成稳定的互利共生关系[13,34]。本研究中异针茅样品采集于青海高原地区，其地理环境和气候表现出高海拔、年积温低和植物生长季短等特征[35]；内生真菌侵染能提高异针茅对高寒极地环境的适应性，增强对病虫害的抵抗能力和降低草食家畜的采食频次[36]。本研究通过对两个地理种群异针茅所感染内生真菌的菌落颜色、质地、生长速率、分生孢子大小等形态学特征的观测，发现异针茅感染内生真菌菌落在PDA培养基上的形态和生长特征出现差异，表现出形态多样性(图1)。异针茅菌株在同一培养条件下所出现的外部形态特征差异，主要取决于自身的遗传组成特征，同时也是遗传多样性的外在表现形式[37]。笔者先后对紫花针茅、睡眠草(Achnatuerumrobustum)、竖针茅(Achnatuerumeminens)、羽茅、羊草、醉马草等禾草所感染的内生真菌的菌落形态、菌落生长速度、分生孢子大小和分生孢子梗长度进行形态学观察，并辅以分子测序手段构建系统发育树，将它们所携带的内生真菌鉴定为不同的Epichloё属内生真菌[18-20,23,28,38]，发现上述大多数禾草所感染的Epichloё内生真菌表现为宿主特异性，而部分禾草种类携带的Epichloё内生真菌表现出多样性特征。例如：从紫花针茅中分离得到E.chisosa、E.inebrians和E.gansuensis3种内生真菌[28]；中国醉马草中分离得到E.gansuensis和E.inebrian两种内生真菌[18]；内蒙古羽茅中分离得到E.gansuense和E.sibiricum两种内生真菌等[19]，这几类禾草携带的Epichloё内生真菌均表现出多样性特征，本研究所得的结论与上述研究结果一致。导致冷季型禾草感染内生真菌形态多样性的主要原因为：1)冷季型禾草主要分布于高原地带，系寒旱生植物；而冷季型禾草通常为Epichloё属内生真菌主要宿主；同时，内生真菌侵染可以提高禾草对高寒极地环境的适应性[39]； 另外， 极地环境也对生长于该区域的物种形态特性具有较高的可塑性[40]。例如，陈钊等[41]研究不同海拔披碱草(Elymusdahuricus)形态特征的可塑性发现，随着海拔的升高，披碱草高度、旗叶长度和穗长呈下降趋势；而颖片长度、外稃长和芒长随着海拔的升高呈上升趋势。2)冷季型禾草与其侵染的内生真菌所形成的共生体是双方长期适应性进化的结果，由于禾草内生真菌共生体生存环境，冷季型禾草和内生真菌基因型的差异，造成宿主植物感染内生真菌的形态特征出现差异[36,42]；3)体外分离培养条件等的差异造成内生真菌的形态多样性[43]。这也从另一个角度反映出：形态学分类很难准确地反映内生真菌的分类学地位。

图3 异针茅(tef)内生真菌系统进化最大简约树Fig.3 Molecular phylogeny derived from ML analysis of introns of tef gene from related Epichloё species and S. aliena 树长The length of phylogeny=607 bp; 一致性指数Consistency index(CI)=0.873; 保留指数Retention index(RI)=0.905; 复定一致性指数Rescaled consistency index(RC)=0.887. 将Claviceps purpurea AF276508作为外群 Claviceps purpurea (AF276508) was designated as the outgroup for rooting trees.

图4 异针茅(actin)内生真菌系统进化最大简约树Fig.4 Molecular phylogeny derived from ML analysis of introns of actin gene from related Epichloё species and Stipa aliena 树长The length of phylogeny=659 bp; 一致性指数Consistency index(CI)=0.876; 保留指数Retention index(RI)=0.923; 复定一致性指数Rescaled consistency index(RC)=0.809. 将Claviceps purpurea AF276509作为外群。 Claviceps purpurea (AF276509) was designated as the outgroup for rooting trees.

目前，管家基因表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中高度保守且持续表达，因此管家基因常被用于分子技术—多位点基因分析[12]。本研究中，采用编码蛋白(tub)、转录延长因子(tef)和肌动蛋白(actin)3种管家基因对异针茅感染的内生真菌基因组进行扩增，结合已经公布的针茅族和其他Epichloё属内生真菌序列构建系统发育树，发现Yssa 5和Yssa 9(图2～4)与短柄草分离的有性态内生真菌E.sylvatica形成明显的分支；而Tdsa菌株所得序列与醉马草分离的无性态内生真菌E.gansuensis组成另外一个分支(图2和图4)，同时还与醉马草分离的无性态内生真菌E.inebrians组成一个分支(图3)；所以将异针茅所感染的内生真菌暂鉴定为E.gansuensis、E.inebrians、E.sylvatica。可见，异针茅内生真菌表现出宿主非特异性，这与前人在其他冷季型禾草内生真菌分离和鉴定的研究结果相近[19-20,28,38]。例如：李伟等[44]分析22株Epichloё内生真菌的遗传多样性，发现这些菌株之间存在一定的遗传多样性。陈永敢等[45]利用PAPD标记对我国Epichloё内生真菌进行了真菌种类、宿主种类、采集地和菌株间的遗传多样性探讨，结果表明遗传多样性丰富，许多不同宿主的菌株独立聚类；同时，不同地理环境、不同种类的菌株聚类也不同。Zhu等[20]研究发现内蒙古羽茅同时感染E.gansuense和E.sibiricum两种内生真菌；Moon等[38]也从南美洲刺猬草(Echinopogonovatus)体内分离出两种Epichloё内生真菌。对于出现一种禾草携带多种内生真菌的情况，笔者对此现象展开了探讨，并且认为出现这种现象的可能原因在于：1)禾草内生真菌的传播方式主要为靠种子传播的垂直传播和靠分生孢子传播的水平传播；在自然环境下，牛羊啃食活动会给宿主叶片和茎秆造成机械伤口，这将为靠水平传播为主内生真菌的分生孢子提供侵染机会，造成原本以垂直传播为主的内生真菌共生体感染同域以水平传播为主的其他种类的内生真菌，并最终形成宿主感染的内生真菌出现多样性[46]。2)部分禾草内生真菌的基因组保持较高的变异位点，导致其Epichloё内生真菌存在基因多样性。例如：Zhang等[19]发现内蒙古羽茅同时感染E.sibiricum和E.gansuense内生真菌，并且发现一些内生真菌是杂合，表明可能存在不同羽茅内生真菌种群间的杂交现象。本研究中异针茅内生真菌基因组的变异位点高于保守位点和简约位点，导致异针茅可能出现了感染不同内生真菌的现象。3)宿主间的亲缘关系和感染内生真菌的非特异性，造成同一宿主可能感染不同种类的内生真菌。醉马草和异针茅同属针茅族且分布地理环境相似[10,47]，说明异针茅与醉马草可能存在一定的亲缘关系。例如，醉马草感染的两种无性态内生真菌可以通过宿主跳跃方式感染异针茅[48]，进而使异针茅感染E.gansuensis和E.inebrians两类内生真菌。而短柄草感染的内生真菌属于有性态内生真菌[12]，且短柄草多分布于温带和热带地区[49]，与异针茅的分布环境出现较大的差异，笔者推断异针茅与短柄草无亲缘关系。而异针茅携带的E.sylvatica与短柄草感染的是同一个内生真菌，表明异针茅携带的E.sylvatica可能是内生真菌出现宿主非专一性，出现这种现象的原因可能与异针茅出现混合进化状态有关，即异针茅可能同时出现有性态和无性态内生真菌种类[50]。

综上所述，异针茅所感染的内生真菌初步鉴定为E.gansuensis、E.inebrians、E.sylvatica，异针茅与内生真菌间未形成严格的宿主特异性，表现出内生真菌多样性，这可能与生长环境、宿主和感染的内生真菌基因型等因素有关。由于本研究仅对青海高原两个地理种群异针茅的内生真菌进行形态观测和系统发育树构建，且未进行多个样本基因组多样性的分析；所以，后续的研究还需要扩大异针茅的检测范围，以及需要进一步验证异针茅内生真菌基因多样性，以此来揭示异针茅内生真菌的起源和分化过程。