啤酒花不同外植体筛选及再生体系构建

杨轲，陈一酉，汪军成，姚立蓉，孟亚雄，马小乐，李葆春，司二静，王化俊*

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

啤酒花(Humuluslupulus)为桑科葎草属多年蔓性草本植物，在我国主要于新疆、内蒙古、甘肃、山东等地栽培[1-2]，既为食品加工原料，又为药用植物，具有极高生产价值，但对栽培技术要求高、生产难度大、生长周期长。啤酒花作为啤酒的主要生产原料，其雌性花序所含α-酸赋予了啤酒独特的香味和苦味，同时能提高啤酒的抑菌防腐和泡沫稳定性[3-4]。啤酒花对多种类型的病原微生物均较敏感，易受病毒侵害，啤酒花潜隐病毒(hop latent virus，HplV)和啤酒花潜隐类病毒(hop latent viroid，HpLVd)为两大主要病害[5]，严重影响啤酒花品质及产量，尤其会降低啤酒花α-酸含量。因此，利用基因工程技术培育抗病毒、稳产、高质量的优质啤酒花品种对其产业发展具有重要意义。

构建稳定、高效的植物再生体系是利用基因工程进行育种改良的基础。国内外对啤酒花再生体系研究报道较少。Skof等[6]使用不定芽再生能力不同的啤酒花品种，对外植体的选择和再生培养基进行优化。宗凯利等[7]在国内首次建立了以节间外植体为供试材料的两个啤酒花主栽品种‘麒麟丰禄’和‘青岛大花’再生体系。许慧敏等[8]对‘于勒比特’啤酒花选用不同外植体、不同外源激素及不同培养基进行了愈伤组织培养。但啤酒花再生依然存在效率低、周期长、稳定性差的问题，阻碍了基因工程技术改良啤酒花性状的发展。

不同外植体的选择对植株再生体系的构建至关重要。Trojak-Goluch等[9]研究发现不同外植体类型和植物生长调节剂对植株再生率有影响。采用菊苣(Cichoriumintybus)子叶为外植体，出愈率显著提高，达到93.31%[10]。张旭红等[11]以欧洲百合(Liliummartagon)无菌苗鳞片为外植体，探究了不同浓度TDZ(噻苯隆，thidiazuron)分别与NAA(萘乙酸，1-naphthaleneacetic acid)和PIC(毒莠定，picloram)组合使用对胚性愈伤组织诱导的影响，确定了最适再生培养条件。以鳄嘴花(Clinacanthusnutans)幼嫩茎段为外植体，成功提高了鳄嘴花繁育系数，建立了完整高效的离体快繁技术体系[12]。柳福智等[13]以甘草(Glycyrrhizauralensis)无菌苗的下胚轴为材料，分析了不同浓度无机盐及不同成分间的交互作用对甘草愈伤组织增长量的影响。叶兴国等[14]研究发现植物组织培养存在很强基因特异性，明确植物离体培养性状的调控及遗传机制，有助于提高植株再生率。相关研究表明，啤酒花不同外植体类型对其植株再生频率也有重要影响，不同生长素浓度及碳源处理下啤酒花试管苗生根移栽成活率差异明显[15-16]。目前，啤酒花再生体系外植体的研究多选择节间和叶盘，而以腋芽为主要外植体进行愈伤组织诱导、构建啤酒花再生体系的研究鲜有报道。

因此，本研究以不同基因型啤酒花种质进行外植体筛选和再生体系的构建，通过激素诱导扦插枝条生根[17]，获得生根率最佳的种质材料；以啤酒花叶片、腋芽和根尖为外植体材料进行离体培养，设置不同激素配比组合，以期筛选出最适啤酒花外植体供体材料并建立高效稳定再生体系,为啤酒花种质保存，离体快繁及基因工程改良操作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

根据杨轲等[18]筛选的50份啤酒花核心种质的综合聚类分析，从中获得性状优异的5份不同基因型种质PJ043、PJ267、PJ028、PJ105、PJ274，于2017年开花前取长度为15 cm左右半木质化枝条用于扦插生根，组织培养及快繁再生体系构建的原始材料。

1.2 优质外植体筛选

1.2.1啤酒花扦插枝条诱导生根 针对上述5份材料，分别剪取15 cm左右半木质化、生长健壮的中部枝条各40株，保留2～3叶。用0.2% KMnO4溶液浸泡枝条根部30 min 进行杀菌消毒，然后将枝条置于1000 mg·kg-1的乙哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)中浸泡15～20 s，扦插到水中，在20～25 ℃、弱光(1000～2000 lx)培养室诱导生根，培养10 d后观察、统计生根率。

1.2.2啤酒花扦插枝条发芽 将1.2.1中生根良好的枝条，转入含有微量元素[FeSO4·7H2O 26 μg·L-1、EDTA-2Na 28 μg·L-1、H3BO33.2 μg·L-1、MnSO4·4H2O 1.8 μg·L-1、ZnSO4·7H2O 0.22 μg·L-1、CuSO4·5H2O 0.08 μg·L-1、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.02 μg·L-1]和大量元素(表1)的5种不同培养液中培养30 d，每5 d更换一次培养液，定期观察啤酒花扦插枝条的生长状况，以蒸馏水培养作为对照，30 d后观察枝条发芽情况。

表1 营养液大量元素组成Table 1 The composition of mineral elements in nutrient solution (mg·L-1)

注：A1为霍格兰营养液配方; A2为日本园试配方; A3～A5为自制营养液。

Note: A1is Hoagland nutritional formula; A2is Japanese garden test formula; A3-A5are homemade nutrient formula.

根据1.2.1和1.2.2实验结果，选择扦插枝条诱导生根和发芽最优异的啤酒花材料用于再生体系构建的外植体供体，分别截取啤酒花根尖、叶片、带腋芽的茎段作为外植体材料。

1.3 外植体愈伤组织诱导

1.3.1外植体的处理 将外植体分别用75%的酒精浸泡30 s后，无菌水冲洗3次，然后加入15% H2O2灭菌25 min后，用无菌水冲洗3次。叶片切成0.5 cm2块状，腋芽与根尖切成0.5 cm的小段。

1.3.2愈伤组织诱导激素配比筛选 将1.3.1切取的外植体接种于基础培养基[MS培养基+2 g·L-1PVP(聚乙烯吡咯烷酮，polyvinylpyrrolidone)+0.002 g·L-1谷氨酰胺]上，并添加不同浓度的6-BA(6-苄氨基嘌呤，6-benzylaminopurine)和IAA(吲哚乙酸，indole-3-acetic acid)进行愈伤组织诱导。激素组合模式为B1：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.05 mg·L-1；B2：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.10 mg·L-1；B3：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1；B4：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.10 mg·L-1；B5：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1；B6：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 0.20 mg·L-1。每皿接种15个外植体，3次重复，25 ℃弱光条件下培养，定期观察，30 d后统计愈伤组织诱导情况，筛选最佳外植体材料。

1.3.3腋芽愈伤组织激素配比优化 为了提高啤酒花腋芽愈伤组织的诱导率，在试验得出最适激素浓度配比基础上，对该培养体系的激素浓度进一步优化，设置不同的激素类型及浓度配比进行腋芽愈伤组织诱导培养，筛选最佳激素组合。激素调控模式为C1：6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C2：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C3：6-BA 0.05 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C4：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C5：6-BA 0.10 mg·L-1+IAA 2.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1；C6：2,4-D 0.3 mg·L-1。每皿接种15个愈伤，3次重复，培养条件同1.3.2。

1.3.4腋芽愈伤组织可溶性糖、可溶性蛋白含量测定 参照施海涛[19]的方法，测定各处理腋芽愈伤组织中可溶性糖、可溶性蛋白含量。

1.3.5不定芽的诱导 将1.3.3筛选到的最适培养基获得的愈伤组织切成5 mm左右的小块，在基础培养基上继代培养1～2代，然后将愈伤组织继续切割成5 mm左右的小块，转接到不定芽分化基础培养基(MS培养基+20 g·L-1葡萄糖+2 g·L-1PVP+0.002 g·L-1谷氨酰胺+0.1 g·L-1肌醇)上，同时添加不同激素配比(D1：0.01 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA；D2：0.05 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA；D3：0.05 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA；D4：0.10 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA；D5：1.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA；D6：1.50 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA)进行不定芽的诱导，每皿接种15个愈伤，3次重复，培养条件同1.3.2，15 d后统计愈伤不定芽的分化情况。

1.3.6生根培养与炼苗 不定芽高度达到2～3 cm时，将其转接到生根基础培养基(MS培养基+20 g·L-1葡萄糖+2 g·L-1PVP+0.002 g·L-1谷氨酰胺+2 g·L-1水解酪蛋白+0.1 g·L-1肌醇)上培养，同时添加不同6-BA和IBA激素组合(E1：0.1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA；E2：0.1 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1IBA；E3：0.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA；E4：0.2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA；E5：0.2 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1IBA；E6：0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA)。每皿接种15个不定芽，3次重复，培养条件同1.3.2。15 d后统计不定芽生根的分化情况。

待根系长至3 cm左右时，解开封口膜，在室内炼苗3 d后，洗去根系附着的琼脂，移栽到装有营养土、蛭石(体积1∶1)的花盆中，20 ℃弱光条件下保温保湿培养7 d左右，待有新叶芽露出后，转至室外，定期浇灌、管理。

1.4 数据分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，用Duncan多重比较法进行差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 啤酒花扦插枝条诱导生根

图1 不同啤酒花材料扦插枝条激素诱导生根率比较Fig.1 Comparison of hormone-induced rooting rate of cuttings from different hops不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。The different small letters mean significant differences at P<0.05, the same below.

在IBA诱导处理下，啤酒花种质PJ028、PJ043、PJ105、PJ267和PJ274生根率差异显著(P<0.05)，依次为53.33%、72.00%、63.33%、81.67%和85.00%，种质PJ274扦插枝条生根率最高(图1)。由此可确定PJ274为理想的啤酒花扦插枝条材料。

2.2 不同水培液对啤酒花扦插枝条发芽率及根系生长的影响

采用不同水培液对啤酒花PJ274进行扦插培养，测定发芽率并观察啤酒花扦插枝条根系生长情况，各处理下根系均生长状况良好，呈白色。由表2可知，水培处理下发芽率、生根数和根长均显著高于蒸馏水对照(P<0.05)。水培2发芽率最高，为40%，水培3发芽率最低，为15%；水培2平均生根数最高，为72条，水培1、4和5次之，水培3最低，生根数仅为36条；水培1平均根长8.92 cm，为水培体系中最高，水培2次之。从这些数据可以确定，水培2作为处理对啤酒花进行扦插培养，生长状况良好且发芽率高(图2A)。

表2 不同培养体系对啤酒花生长的影响Table 2 The analysis of different nutrient solutions on the growth of hops

注：同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著，下同。

Note: The different small letters within the same column indicate significant differences at the 0.05 level. The same below.

2.3 不同激素配比对不同外植体愈伤组织诱导的影响

2.3.1筛选最佳外植体进行愈伤组织诱导 以啤酒花PJ274在水培2中获得的扦插枝条为材料，叶片切成0.5 cm2块状，腋芽与根尖切成0.5 cm的小段，灭菌处理后分别置于添加不同6-BA和IAA激素组合的基础培养基上，诱导愈伤组织。3种外植体均能成功诱导愈伤组织形成(表3)，B4无法诱导腋芽和根尖愈伤组织形成，B2是最佳激素组合，并与其他激素差异显著(P<0.05)，腋芽诱导率最高，为51.11%，愈伤组织生长致密(图2B)。

2.3.2诱导腋芽愈伤组织不同激素配比优化 为了提高啤酒花腋芽愈伤组织的诱导率，在2.3.1试验得出最适激素浓度配比基础上，对该培养体系的激素浓度进一步优化，设置不同的激素类型及浓度配比，筛选诱导腋芽愈伤组织的最佳激素组合。结果表明，激素配比浓度影响愈伤组织的生长，2,4-D对啤酒花腋芽愈伤组织无诱导作用。不同激素模式下愈伤组织诱导率差异显著(P<0.05)，激素组别C3和C6均未能成功诱导出愈伤组织，诱导啤酒花腋芽愈伤组织形成的最佳激素调控模式为C4，诱导率高达86.67%(表4)，不定芽呈嫩绿色且生长状况良好(图2C)，各处理诱导出的愈伤组织中可溶性糖和可溶性蛋白含量随着诱导率的提高而增加，其中激素组别C4处理下愈伤组织中的可溶性糖(图3A)和可溶性蛋白含量(图3B)显著高于其他激素组别。

表3 不同激素组合对啤酒花愈伤组织诱导的影响Table 3 Effects of different hormone combinations on callus induction by hops axillary buds

2.4 不同激素配比对啤酒花腋芽愈伤不定芽分化的影响

综合2.2与2.3结果可知，腋芽为最佳外植体材料。进一步用不同激素配比对啤酒花腋芽愈伤组织进行分化培养获得不定芽。由表5可得，在6组不同的激素配比中，第3组不定芽分化率最低，为15.56%；第5组啤酒花腋芽愈伤组织的不定芽分化率最高，为66.67%，显著高于其他组(P<0.05)。因此，最适诱导腋芽愈伤组织分化不定芽的激素配比为D5(表 5和图2D)。

图2 啤酒花再生体系构建过程Fig.2 Construction process of hops regeneration system A: 水培啤酒花植株Hops seedling under hydroponic culture; B: 腋芽愈伤组织The callus of axillary buds; C: 腋芽愈伤组织继代The subculture of the callus of axillary buds; D: 芽的分化Differentiation of the bud of hops; E: 根的分化Differentiation of the root of hops; F: 再生植株的移栽Transplantation of regenerated plants.

图3 不同激素组合诱导的啤酒花腋芽愈伤组织可溶性糖和可溶性蛋白含量比较Fig.3 Comparison of soluble sugar and soluble protein contents in axillary bud callus of hop induced by different hormone combinations

激素浓度Hormone concentration 平均出愈数Number of callus induced诱导率 Induction rate (%)C13.67±0.3324.44±2.22cC28.67±0.8857.78±5.88bC30.000.00cC43.85±0.5886.67±3.85aC52.33±0.6715.56±4.44cC60.000.00c

表5 不同激素组合对啤酒花腋芽愈伤组织芽分化的影响Table 5 Effects of different hormone combinations on bud differentiation of axillary bud callus of hops

2.5 不同激素调控对啤酒花生根的影响

设置不同的外源激素组合，对分化出不定芽的愈伤组织进行生根诱导。由表6所示，各激素配比处理均能分化出根，但不同处理间差异显著(P<0.05)，其中啤酒花腋芽愈伤组织根分化的最佳激素组合为E2(图2E)，生根率高达66.67%。

2.6 试管苗移栽炼苗

对啤酒花试管苗进行室内炼苗3 d后，移栽到装有营养土和蛭石(体积1∶1)的花盆中，20 ℃温室弱光保温保湿培养7 d，待有新叶芽展露后，转至室外进行培养，试管苗移栽成活率可达80%，植株嫩绿，生长旺盛(图2F)。

表6 不同激素组合对啤酒花腋芽愈伤组织根分化的影响Table 6 Effects of different hormone combinations on root differentiation of hop axillary bud callus

通过外植体选择、愈伤组织诱导、不定芽分化、生根、炼苗和移栽等步骤，最终构建了啤酒花高频稳定的再生体系(图2)。

3 讨论

开展植物再生体系的构建，外植体母体的获取是第一步。近年对啤酒花再生体系的报道中，均未涉及啤酒花外植体母体培养的研究，啤酒花主要栽培模式也基本为土培枝条扦插模式[7-8]。水培作为无土栽培中最广泛应用的方式之一，主要特点是以营养液替代土壤提供植物所需养分对植物进行培植，目前世界范围内用水培模式进行作物生产的比重显著提高[20-22]。Barone等[23]采用水培体系研究番茄(Solanumlycopersicum)和两种微藻在霍格兰营养液中共培养的相互作用，最终证实含有生物刺激素的水培体系对番茄植株的生长有促进作用。本研究采用水培模式，设置5种不同配比水培液，进行啤酒花外植体材料的母体培养。结果发现水培处理下，枝条扦插生根发芽效率显著提高，水培营养成分不同，枝条扦插生根长芽差异显著，尤其在大量元素Ca(NO3)·4H2O 945 mg·L-1，KNO3809 mg·L-1，MgSO4·7H2O 493 mg·L-1和NH4H2PO4153 mg·L-1水培模式下，扦插枝条最大平均生根数可达72条，最高发芽率为40%，根长为7.02～8.92 cm。因此，选用适宜的水培模式是进行啤酒花扦插枝条快速生根发芽的有效途径，与传统土培相比，便于取材管理，节省人力物力，提高效率。

本研究以啤酒花扦插生根发芽的枝条为外植体供体，分离其根尖、叶片、腋芽为外植体进行组织培养，通过比较出愈率和愈伤组织的生长状态，发现带腋芽的茎段愈伤诱导率高达86.67%，该值与菊苣(Cichoriumintybus)腋芽为外植体愈伤组织诱导率33.3%～62.5%相比有明显提高[10]，也优于红宝石球花报春(Primuladenticulata)以腋芽为外植体的组织诱导率73.33%[24]。可溶性糖和可溶性蛋白作为植物组织生长发育的重要能量供体和营养物质，是评价植物组织生长状态的重要因素[25]。本研究对腋芽为外植体，诱导的愈伤组织中营养物质可溶性糖和可溶性蛋白含量测定结果表明，愈伤组织诱导率越高，活性越强，其组织中可溶性糖和可溶性蛋白含量也最高，这与闫永庆等[26]对西伯利亚白刺(Nitrariasibirica)愈伤组织的耐盐性分析的结果相似。因此，可以确定腋芽是啤酒花再生体系构建的适宜外植体。

不同激素配比对植物细胞分化和生长方向均有影响，对植物形态建成发育有引导作用[27]。6-BA配合IAA能够在啤酒花茎段基部诱导出愈伤组织，但芽诱导率低；IBA配合6-BA能使芽诱导率及增殖倍数提高[28]。许慧敏等[8]发现激素浓度为6-BA 0.5 mg·L-1+IAA 1.5 mg·L-1时啤酒花腋芽的愈伤组织诱导率为69.2%。本研究中，6-BA 0.01 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1的激素配比能够成功诱导啤酒花叶片、根尖和腋芽产生愈伤组织，出愈率依次为46.67%、48.89%和51.11%。而进一步优化腋芽愈伤组织诱导激素配比，在含有激素6-BA和IAA 的基础上，添加适量2,4-D，发现6-BA 0.1 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2 mg·L-1的激素组合为啤酒花腋芽外植体最佳激素配比，诱导率高达86.67%，进一步说明本研究中啤酒花腋芽愈伤组织诱导激素组合更具优势。He等[29]以不同浓度6-BA和NAA处理黄柏(Phellodendronchinense)幼苗，结果表明外源激素的浓度高低对黄柏幼苗生长状况有重要调控作用。在本研究中优选出的6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1激素调控组合下，啤酒花最佳愈伤组织不定芽分化率为66.67%，而许慧敏等[8]激素配比为IAA 0.25 mg·L-1+TDZ 2.0 mg·L-1的MS-B5培养基上不定芽诱导率仅为56%，不定芽的诱导率显著提高，为进一步诱导生根创造了良好条件。

4 结论

本研究通过对啤酒花再生体系过程中所需外植体来源、激素配比、培养条件、移栽处理等方面的探索和优化。获得材料PJ274在水培处理下生根发芽能力强，为组织培养外植体最优来源母体，腋芽为最适外植体，在适宜的激素配比处理下，腋芽愈伤组织诱导率达到87.5%，芽的分化率为66.67%，生根率为66.67%，试管苗移栽成活率达到80%，植株生长健壮，最终成功建立了以腋芽为外植体的高频啤酒花再生体系。