四倍体马铃薯SRAP分子遗传连锁图谱的构建

张明飞，于卓，于肖夏，李景伟，马艳红，吴国芳，王颖

(内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

马铃薯(Solanumtuberosum)为菜、粮、饲兼用的四大重要作物之一，其块茎富含淀粉、膳食纤维、蛋白质、维生素、矿物质、抗氧化酚类物质及花青素等成分[1]。在我国马铃薯主粮化战略的驱动下，目前市场上对不同用途马铃薯品种的需求量呈增加趋势，因此选育淀粉、全粉、薯条、薯片及富含花青素等加工专用型马铃薯新品种倍受重视[2-3]。构建植物遗传连锁图谱是从正向遗传学角度进行重要数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)精细定位、功能基因克隆分析及分子标记辅助育种研究的基础。

以往遗传作图多用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)和简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)这两种分子标记，不足点是AFLP操作技术复杂、SSR技术多态性标记数量有限。相关序列扩增多态性(sequence related amplified polymorphism，SRAP)是一种较新的二代分子标记技术，其原理是根据基因中启动子和内含子的碱基AT含量丰富，外显子中碱基GC含量丰富的特点来设计引物进行PCR扩增，因不同个体中的启动子、内含子与间隔区长度不同而产生多态性[4]。SRAP标记具有通用性广、共显性高、多态性丰富、重复性好、易测序及操作简便等优点[5-6]，已被应用于玉米(Zeamays)、小麦(Triticumaestivum)、棉花(Gossypiumspp.)及冰草(Agropyron)等植物的遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究中[7-10]。

目前已有一些关于马铃薯遗传作图的研究报道，如荷兰瓦赫宁根大学的Hans等[11]利用AFLP分子标记构建了第一张二倍体马铃薯的超密度遗传连锁图谱，Bradshaw等[12]采用AFLP和SSR两种标记构建了同源四倍体马铃薯的遗传图谱，金黎平等[13]用AFLP标记建立了我国第一张二倍体马铃薯遗传图谱，崔阔澍[14]利用AFLP和SSR分子标记构建了四倍体彩色马铃薯的高密度遗传图谱。迄今在国内外还未见用SRAP标记技术构建马铃薯遗传连锁图谱的研究报道。

植物分子遗传连锁图谱是进行其品质和产量等重要QTL定位的基础，通常遗传作图要求亲本间的遗传差异大、杂交后代作图群体目标性状分离明显。本试验以四倍体马铃薯YSP-4×MIN-021杂种F1代182个分离单株为作图群体，用SRAP分子标记技术和Join Map 4.0软件构建马铃薯的SRAP分子遗传连锁图谱，以期为马铃薯高淀粉、高干物质及产量等重要QTL定位、分子标记辅助育种及功能基因图位克隆等研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料与种植方式

材料为适应性很强的四倍体马铃薯YSP-4与干物质和淀粉含量高的四倍体马铃薯MIN-021杂交产生的F1代182个分离单株及其亲本，由内蒙古农业大学马铃薯遗传育种研究中心保存并提供。2018年5月种植在呼和浩特市托克托县马铃薯育种基地的网棚中，株距为30 cm，行距为90 cm。土壤为沙质土，生长期间适时适量灌水施肥，以保证马铃薯正常生长发育对水和养分的需求。

1.2 DNA提取与质量检测

在现蕾期，取182个马铃薯杂种F1代单株及其亲本的幼嫩叶片用冰盒带回实验室，称取1.5 g叶片，根据天根生化科技有限公司生产的植物基因组试剂盒说明提取各材料的基因组DNA。1.7%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度后，用日本岛津产UV2401紫外分光光度计测定DNA浓度，稀释至约50 ng·μL-1，置-20 ℃冰箱中备用。

1.3 引物来源

从Li等[4]、Pezzotti等[15]和Lin等[16]报道的SRAP引物中，随机选取正向引物17条、反向引物21条，自由组合成357对引物，送至上海生物工程有限公司合成。

1.4 SRAP-PCR扩增及产物检测

反应体系体积为20 μL，包括10×PCR Buffer(Mg2+)2.5 μL、2.5 mmol·L-1的dNTPs 1.6 μL、5 U·μL-1的Taq酶0.2 μL、10 mmol·L-1的正反向引物各1.2 μL、50 ng·μL-1的模板DNA 1 μL、ddH2O 12.3 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃下延伸1 min，循环5次；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃下延伸1 min，循环35次；72 ℃下延伸10 min后4 ℃保存。PCR产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测[17]。

1.5 数据统计

1.5.1多态性位点统计 电泳胶板上，有条带位点的记录为“1”，无条带位点的记录为“0”，条带位点不清晰或缺失的记录为“-”，生成“0”和“1”组成的数据矩阵。计算多态性条带位点百分率：

P=(K/N)×100%

式中:K表示多态性条带位点数目；N表示检测到条带位点总数[18]。

1.5.2偏分离统计 根据孟德尔分离规律，四倍体马铃薯杂种F1代群体的SRAP标记多态性位点理论上应符合1∶1或3∶1的分离比，在P<0.01和P<0.05的水平上，对多态性位点进行卡方检验，判断其是否发生偏分离并统计其偏分离标记数目。

1.5.3遗传连锁图谱构建 采用Join Map 4.0软件的“CP”作图模型，用扩增得到的马铃薯分离类型为lm×ll(母本型1∶1)、np×nn(父本型1∶1)和hk×hk(双亲共有型3∶1)的SRAP标记，分别构建出马铃薯双亲的SRAP分子遗传连锁图谱，本试验设定的连锁阈值(likelihood of odds, LOD)范围为3.0～5.0。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及分子标记多态性分析

随机取马铃薯YSP-4×MIN-021杂种F1代分离群体中的3个单株和双亲DNA作模板，进行SRAP适宜性引物筛选(图1)。从357对引物中筛选出条带稳定清晰、多态性丰富的引物36对(表1)，利用这些引物对182个杂种F1分离单株的基因组DNA扩增得到742个条带位点，多态性条带位点为598个，多态性比率为80.59%，平均每对引物扩增出多态性位点16.61个，表明F1分离群体的多态性较丰富，遗传差异较大(图2)。

图1 供试材料部分SARP适宜引物的筛选Fig.1 Screening of partial suitable SRAP primers in test materials P1: 母本 YSP-4 Female YSP-4; P2: 父本 MIN-021 Male MIN-021; 1～3: F1 分离单株F1 segregation plants.

2.2 SRAP标记位点的偏分离分析

对PCR扩增得到的598个SRAP多态性标记位点，在P<0.05水平时，卡方检验发现不符合孟德尔分离规律的偏分离标记位点共有127个，其中母本连锁群偏分离标记59个，偏分离标记比率为21.53%；父本连锁群偏分离标记68个，偏分离标记比率为20.99%(表2)。这符合植物遗传作图偏分离标记比率小于30%的要求[19]，可用于构建四倍体杂交马铃薯遗传连锁图谱。

2.3 遗传图谱的构建

利用Join Map 4.0作图软件，在选定LOD值为3.0～5.0条件下，构建出2张四倍体杂交马铃薯双亲的SRAP分子遗传连锁图谱(图3，图4和表3)。母本图谱覆盖基因组总长度为1572.2 cM，含274个标记位点，标记间的平均距离为5.74 cM，12个连锁群的长度范围为14.03～214.44 cM，母本连锁群1标记数目最多(62个)，母本连锁群11标记数目最少(2个)；父本图谱覆盖基因组总长度为1932.23 cM，含324个标记位点，标记间的平均距离为5.96 cM，12个连锁群长度范围为93.65～242.06 cM，父本连锁群5标记数目最多(55个)，父本连锁群8标记数目最少(9个)。

表1 SRAP适宜引物及对供试材料多态性扩增结果Table 1 The sequences and the results of polymorphism amplification of SRAP primers

图2 SRAP引物对部分供试材料的PCR扩增Fig.2 PCR amplification result of partial test materials by SRAP primers M: 100 bp Marker; 1～53: F1代部分单株Partial F1 individuals; A: 引物Bm8Coe7 SRAP primer Bm8Coe7; B: 引物Bm9Be9 SRAP primer Bm9Be9.

连锁群Linkage group(LG)母本连锁群 Maternal linkage group偏分离标记数Number of biased markers多态性标记数Number of polymorphic makers偏分离比率Ratio of distorted (%)父本连锁群 Paternal linkage group偏分离标记数Number of biased markers多态性标记数Number of polymorphic makers偏分离比率Ratio of distorted (%)LG1136220.97124427.27LG293823.68145425.93LG311010.0033010.00LG4103627.782267.69LG562227.27165529.09LG621020.0031323.08LG71166.2552520.00LG8144729.792922.22LG92219.5241723.53LG1006021513.33LG1102011010.00LG121425.0042615.38合计Total5927421.536832420.99

图3 四倍体杂交马铃薯母本(YSP-4)SRAP分子遗传连锁图谱Fig.3 The female (YSP-4) molecular genetic linkage maps of tetraploid hybrid potato

3 讨论

偏分离是生物进化的重要动力之一[20]。研究表明造成偏分离现象的因素较多，如基因组结构上发生突变、插入、缺失或重排[21]，非同源重组、基因转化和转座因子[22]，细胞质DNA的母性遗传[23]，标记类型和群体类型[24]等。在植物遗传作图时标记偏分离现象普遍存在[25-26]，偏分离标记比率通常为6.8%～31.8%[27]。Bradshaw等[28]通过实验证明，在遗传作图中偏分离标记与符合孟德尔分离规律的标记具有同等效果，若去除偏分离标记可能导致某些连锁群上的标记失去连锁关系。一般认为偏分离比率<30%的标记用于遗传作图不会影响图谱的准确性[19]。本试验得到的598个SRAP标记中有127个标记发生偏分离现象，在母本YSP-4和父本MIN-021各自的遗传连锁图谱中，偏分离标记比率分别为21.53%和20.99%，均明显低于30%，说明本试验所建立的2张四倍体杂交马铃薯双亲的遗传图谱是准确的。

表3 四倍体杂交马铃薯双亲连锁群的基本特征Table 3 The basic characteristics of parental linkage groups in tetraploid hybrid potato

对植物遗传图谱标记间平均距离的要求因研究用途不同而异。一般认为，用于基因定位的图谱要求标记间平均距离为10～20 cM，用于QTL定位要求标记间平均距离<10 cM，用于基因图位克隆要求标记间平均距离<1 cM[29-30]。本试验构建的2张马铃薯亲本图谱中，母本YSP-4图谱的标记间平均距离为5.74 cM，父本MIN-021图谱的标记间平均距离为5.96 cM，均明显小于10 cM。表明双亲的SRAP分子遗传连锁图谱可用于马铃薯块茎淀粉、干物质及产量等重要QTL和其相关基因的定位研究。另外，在双亲图谱的12个不同连锁群上，SRAP标记分布还不够均匀且有较大空隙，这可能与试验获得的标记数目仍然偏少有关，需进一步筛选SRAP适宜引物，扩大作图标记数目，进行双亲遗传图谱的加密研究。

4 结论

1)试验筛选出36对SRAP适宜引物，对四倍体马铃薯“YSP-4×MIN-021”的杂种F1代182个分离单株及其双亲的基因组DNA进行扩增，获得了598个SRAP分子标记。

2)构建了2张四倍体杂交马铃薯双亲的SRAP分子遗传连锁图谱。母本YSP-4图谱含274个SRAP分子标记，标记间平均距离为5.74 cM，12个连锁群总长度为1572.2 cM；父本MIN-021图谱含324个标记，标记间平均距离为5.96 cM，12个连锁群总长度为1932.23 cM。