青海高寒草地针茅根际土壤细菌拮抗功能评价及鉴定

刘雪儿，马金凤，杨成德，李统华

(甘肃农业大学植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

不科学的使用化学农药，导致农产品中农药残留量超标，影响生态平衡，加剧“3R”问题，并且使病原物产生抗药性[1]，这与生态农业的目标相悖。生物防治主要利用有益微生物对病原菌的拮抗作用来减少病原物的数量和削弱其致病性，同时诱导或增强植物抗病性[2]。目前国内在黄瓜枯萎病(Fusariumoxysporumf. sp.cucumerinum)[3]、西瓜枯萎病(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)[4]、甜菜根腐病(Fusariumspp.)[5]和烟草黑胫病(Phytophthoranicotianae)[6]等作物土传病害生物防治研究较多。根际指植物根系与土壤微生物之间相互作用所形成的独特圈带[7]；根际微生物是在植物根系直接影响的土壤范围内生长繁殖的微生物，与植物关系密切，种类繁多[8]，且不同植物、不同耕作方式，土壤细菌的群落组成也不尽相同[9-12]，其中存在许多对植物有益的细菌群落，包括生防细菌、能生产植物生长激素的细菌和固氮菌等[9]，是微生物资源宝库之一。针茅属(Stipa)植物属于旱生、中旱生、广旱生密丛型禾草，在中国主要分布于内蒙古高原、黄土高原、青藏高原及新疆阿尔泰山和天山等山地[13]，其中异针茅(S.aliena)和疏花针茅(S.penillata)主要分布于较湿润的高寒地区，是组成高寒草甸草原的主要优势种，本氏针茅(S.capillata)是一种较喜暖的旱生丛生禾草，是我国暖温型典型草原的建群种，紫花针茅(S.purpurea)是青藏高原的特有成分，广泛分布于青藏高原海拔 4500～5200 m 的高原及山地，最高可达到5400 m[13]，在这种极端生境下其根际土壤细菌是否丰富？拮抗功能是否强大？因此，本试验以青海高寒草地针茅根际土壤细菌为研究对象，以番茄早疫病菌(Alternariasolani)、马铃薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、马铃薯坏疽病菌(Phomafoveata)和马铃薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)为指示菌评价其拮抗能力并进行鉴定，以期为青海高寒草地针茅根际土壤细菌的开发提供依据，也为农业生防菌剂的开发提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试土样及菌种 供试土样：于2016年8月在青海省海晏县青海湖乡达五德吉村(东经100°52′42″，北纬37°04′08″)采集异针茅、疏花针茅、本氏针茅和紫花针茅根际土壤样品，随机挖取5丛植株及根系周围土壤带回实验室，将植株根系从土壤中轻轻分出，抖落其表面土壤视为根际土立即进行分离培养。

供试病原菌：番茄早疫病菌、马铃薯枯萎病菌、马铃薯坏疽病菌和马铃薯炭疽病菌均由甘肃农业大学植物保护学院植物病原细菌及细菌多样性实验室提供。

1.1.2供试培养基[14]牛肉膏蛋白胨(NA)培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨6 g、葡萄糖15 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L;LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g、蒸馏水1 L，用于根际土壤细菌分离培养。

马铃薯葡萄糖(PDA)培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，用于病原真菌培养及对峙培养。

1.2 试验方法

1.2.1土壤细菌的分离及纯化 将10 g土样，置于盛有90 mL无菌水的三角瓶中，在28 ℃摇床上振荡约30 min，逐级稀释至10-4和10-5mol ·L-1，分别取各浓度对应的土壤悬浮液0.1 mL 均匀涂布于固体LB平板上，每个浓度梯度重复3次，28 ℃条件下培养48 h；统计所有重复的菌落数并挑选其培养特征明显相异的单个菌落，于LB平板进行划线纯化，后于4 ℃保存备用[15]。

1.2.2土壤细菌培养形状及形态观察 将土壤细菌接种于NA培养基，置于28 ℃培养箱中培养72 h，观察单菌落形态特征并描述；将活化18 h后的菌株进行革兰氏染色，观察菌体颜色和形态，并进行大小测量(30个)和显微拍照[14]。

1.2.3拮抗功能评价 采用平板对峙培养法[16]评价土壤细菌对4种指示菌的拮抗能力。首先，用直径为6 mm的打孔器在4种指示菌平板边缘打孔，并将指示菌菌饼接入PDA平板中央，其次，用无菌牙签在病原菌菌饼周围2.5 cm等距离接种待测细菌，每处理重复3次，马铃薯坏疽病菌置于15 ℃培养，其他3种指示菌于28 ℃条件下培养，直至对照菌落满皿后用十字交叉法测量抑菌直径并计算抑菌率。

抑菌率=(对照的菌落直径-处理的菌落直径)/(对照的菌落直径-菌饼直径)×100%

1.2.416S rDNA鉴定 土壤细菌活化后在LB培养液中振荡过夜培养，后按天根生化科技有限公司试剂盒(离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒)提取DNA，利用16S rDNA通用引物：引物27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和引物 1492 R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′进行PCR扩增[16]；PCR扩增体系为50 μL，其中DNA模板2 μL，Master Mix 25 μL，1492R 2 μL，27F 2 μL，ddH2O 19 μL。

PCR反应条件为94 ℃ 4 min预变性，之后94 ℃ 30 s变性、60 ℃ 30 s退火、72 ℃ 90 s延伸，共30个循环，再72 ℃ 10 min延伸完成扩增。将PCR扩增产物送至武汉金开瑞生物工程有限公司进行测序，所测序列与GenBank数据库中已知序列进行比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)并用Mega 7.0软件构建系统发育树，明确其系统发育关系。

1.3 数据分析

运用 Excel 2010统计分析并处理数据，并用Mega 7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌的分离和纯化

将青海采集的异针茅、本氏针茅、紫花针茅和疏花针茅根际土壤样品经稀释分离培养，在10-5mol·L-1浓度下, 能够形成清晰独立的菌落。统计结果表明，该生境土壤细菌数量较丰富，菌落数介于106～107cfu·g-1(表1)。

表1 针茅属根际土壤细菌数Table 1 Soil bacteria amounts of the Stipa rhizosphere (cfu·g-1)

根据培养性状，异针茅根际土壤样品中分离到8株土壤细菌，分别编号为3T1至3T8；本氏针茅根际土壤样品中分离到6株土壤细菌，分别编号为4T1、4T2、4T3、4T4、4T5和4T7；紫花针茅根际土壤样品中分离到6株土壤细菌，分别编号为5T1、5T2、5T3、5T6、5T7和5T8；疏花针茅根际土壤样品中分离得到3株土壤细菌，分别编号为10T1至10T3。共分离得到23株菌株，保存备用，但在研究过程中6株菌株失活，不能再继代培养。

2.2 培养形状及形态观察

2.2.1培养形状观察 根据表2，异针茅根际土壤细菌菌落均为圆形，菌落大小为2～6 mm，除3T5表面无光泽外，其他表面都有光泽且凸起，基本不透明，菌落颜色为乳白色或乳黄色；本氏针茅根际土壤细菌除4T3菌落为不规则形外其他均为圆形，菌落大小为0.1～8.5 mm，4T3和4T5表面无光泽，其他表面都有光泽且凸起，基本不透明，菌落颜色为白色或黄色；紫花针茅根际土壤细菌菌落均为圆形，菌落大小为2～5 mm，5T2表面无光泽，其他表面都有光泽且凸起，基本不透明，菌落颜色为白色或者黄色；疏花针茅根际土壤细菌中，10T1菌落为不规则形其余都为圆形，菌落大小为2～6 mm，10T1表面无光泽且平展，其他表面都有光泽且凸起，基本不透明，菌落颜色为白色或者黄色。该结果表明青海高寒草地不同种针茅根际土壤细菌培养性状差异明显。

2.2.2形态观察 23株土壤细菌均呈革兰氏阳性，杆状(表3)。异针茅根际土壤细菌菌体差别明显，其中3T7菌体最长，达9.98 μm，3T6菌体最宽， 为2.93 μm，其他菌株介于两者间； 本氏针茅根际土壤细菌中菌体最长和最宽的菌株分别为4T5和4T3，分别达9.91和3.03 μm，其他菌株介于两者间；在紫花针茅根际土壤细菌中，菌体最长和最宽的菌株均为5T2，分别为10.5和2.37 μm，其他菌株介于两者间；疏花针茅根际土壤细菌10T1菌体最长，为6.04 μm，10T3菌体最宽，为1.72 μm，其他菌株介于两者间。总体看，针茅属不同种根际土壤细菌表现出明显的形态差异。

G+: 革兰氏阳性 Gram-positive bacteria.

2.3 拮抗功能评价

结果表明，青海高寒草地异针茅、本氏针茅、紫花针茅和疏花针茅根际土壤细菌中拮抗菌所占比例为0、17%、17%和67%，其中具有强拮抗能力的菌株为4T1、5T1、10T1和10T3，特别是10T1对番茄早疫病菌、马铃薯枯萎病菌、马铃薯坏疽病菌和马铃薯炭疽病菌的抑菌率分别为67.14%、68.57%、61.43%和75.71%(图1，表4)。总体看高寒草地针茅根际土壤细菌中具有较多拮抗菌株，且抑菌能力强，抑菌谱较广，但不同种间根际土壤细菌拮抗能力有差异。

表4 优良拮抗土壤细菌的抑菌作用Table 4 Antagonistic effect of excellent antagonistic soil bacteria (%)

图1 10T1的抑菌作用Fig.1 The antagonistic effect of 10T1 A: 番茄早疫病菌A. solani; B: 马铃薯坏疽病菌P. foveata; C: 马铃薯炭疽病菌C. coccodes; D: 马铃薯枯萎病菌F. avenaceum.

2.4 16S rDNA序列分析

对17株可以继代培养的菌株经PCR扩增和测序，于GenBank数据库中进行序列比对和构建系统发育树，并结合培养性状和形态特征，将此17株菌鉴定为7属12种(表5)，其中8株土壤细菌鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，其中3T2和4T5为简单芽孢杆菌(B.simplex)、4T2和4T3为苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、10T1为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、5T2为蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、3T5为维德曼芽孢杆菌(B.wiedmannii)，3T8为韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)，占总株数的47.05%，为优势属。另外，将3T4、3T7和4T7鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，3T6鉴定为摩拉维亚假单胞菌(Pseudomonasmoraviensis)，5T3和10T2鉴定为乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoacetius)，4T1鉴定为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)，5T7鉴定为藤黄微球菌(Micrococcusluteus)，5T8鉴定为氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans)(图2)。

表5 针茅属不同根际土壤细菌的种类Table 5 Soil bacteria types of the Stipa rhizosphere

图2 针茅属根际土壤细菌系统发育树Fig.2 Soil bacteria phylogenetic tree of the Stipa rhizosphere

异针茅根际土样中共分离到6株菌，其中3株为芽孢杆菌属，2株为寡养食单胞菌属，1株为假单胞菌属，且假单胞菌属为异针茅所特有(表5)；本氏针茅根际土样中分离到5株菌，其中3株为芽孢杆菌属，1株为寡养食单胞菌属，1株为泛菌属，且泛菌属为本氏针茅所特有；紫花针茅根际土样中4株菌，分别属于芽孢杆菌属、不动杆菌属、微球菌属和微杆菌属；疏花针茅根际土样中的2株菌分别属于芽孢杆菌属和不动杆菌属。

3 讨论与结论

土壤细菌是土壤中最丰富，分布最广泛的微生物类群[17-18]，在农业生产中又可分为有益和有害细菌。为了农业高产稳产，人们对有益细菌进行了大量研究。早在1962年，张宪武等[19]已开始大豆(Glycinemax)根际土壤细菌的研究，但是有关高寒极端生境土壤细菌的研究报道较少。种植地区、耕作方式及作物种类等因素不同，土壤细菌的数量也存在差异。李荣坦等[20]研究低磷胁迫对番茄(Solanumlycopersicum)根际土壤细菌多样性的影响，发现低磷胁迫处理下，“红宝石1号”根际可培养细菌数量最多，为40.32×106cfu·g-1；江曙等[21]对不同地区当归(Angelicasinensis)根际微生物种群结构进行研究，发现在当归生长过程中，微生物数量逐渐增加，10月以后又开始下降，且岷当归根际中分离到36株细菌，细菌数量最多时达(124.6±6.8)×106cfu·g-1。本试验所研究的针茅根际土壤中分离的细菌数量介于6.4×106～36.0×106cfu·g-1，与以上文献报道基本一致。

高明华等[22]对呼伦贝尔草甸草原优势种群羊草(Leymuschinensis)根际微生物进行了研究，结果显示，羊草根际土壤中共分离得到36株细菌，分属于7个属，其中芽孢杆菌属17株；周阳薇等[23]对12种不同植物根际的土壤细菌进行了分离，并初步确定了细菌的分类地位，共得到137株细菌，分属于8个属，且芽孢杆菌属为优势属，占81.0%。而本试验从4份针茅根际土样中分离得到23株细菌，17株可转代，分属于7个属，其中芽孢杆菌属8株，为优势属，从菌株数看较少，但属数与上述文献基本一致。

生防细菌具有繁殖速度快、代谢产物复杂多样、与病原菌作用方式广、易于培养等特点，且生防芽孢杆菌抗逆性强，具有良好的生防效果[24]。据报道苏云金芽孢杆菌[25]、蜡状芽孢杆菌[26]和解淀粉芽孢杆菌[27]均具有良好的生物防治作用，其中苏云金芽孢杆菌常用来防治各种农业害虫和植物寄生线虫，蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌常用来防治各种植物病害。本试验共分离得到23株细菌，其中4株具有强抑菌作用，特别是疏花针茅根际菌株10T1对番茄早疫病菌、马铃薯枯萎病菌、马铃薯坏疽病菌和马铃薯炭疽病菌的抑菌率分别为67.14%、68.57%、 61.43%和75.71%，并将其初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。冯中红等[28]从东祁连山高寒草地牧草分离筛选的内生细菌解淀粉芽孢杆菌264ZY7对马铃薯炭疽病菌和马铃薯枯萎病菌的抑菌率分别为38.17%和49.60%；冯金龙等[29]报道解淀粉芽孢杆菌S27对马铃薯枯萎病菌和马铃薯炭疽病菌都有良好的抑菌效果，其中对马铃薯炭疽病菌的抑菌率为75%；畅涛等[30]报道解淀粉芽孢杆菌B-401对马铃薯坏疽病菌、马铃薯炭疽病菌和番茄早疫病菌的抑菌率分别为74.45%、70.05%和60.25%。此外，还有报道解淀粉芽孢杆菌可以防治番茄枯萎病[24]、玉米(Zeamays)纹枯病[31]、丝瓜(Luffacylindrica)炭疽病[32]和草莓(Fragariaananassa)灰霉病[33]等植物病害。本试验所分离的解淀粉芽孢杆菌10T1具有广谱抑菌作用，对马铃薯炭疽病菌和马铃薯枯萎病菌的抑菌率高于冯中红等[28]的报道，与冯金龙等[29]和畅涛等[30]的报道基本一致，对番茄早疫病菌的抑菌率高于畅涛等[30]的报道，说明菌株10T1抑菌谱宽，抑菌能力强，有被开发为良好的生防制剂的潜力。

随着人们对极端环境微生物的深入了解，意识到极端生境微生物为适应极端环境形成了独特的生物活性物质合成途径或者代谢途径，并能产生许多特殊的生物活性物质，有良好的开发前景，如嗜冷菌产生的低温酶，在洗涤防治、食品加工、植物保护、环境保护等方面起着至关重要的作用[34]。本试验所分离菌株均能在青海海拔高，气候寒冷，温度低的极端生境生存，抗逆能力强，可能具有良好的开发应用潜力。但本试验仅对室内抑菌功能进行了测定，还需进一步研究其抑菌谱、抑菌机理及发酵条件等，为生防菌剂的开发奠定基础。