草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯田间杂草的防效及安全性评价

贾小霞 刘 石 齐恩芳 吕和平 文国宏李 掌 马 胜 曲亚英

(1 甘肃省农业科学院马铃薯研究所/甘肃省马铃薯种质资源创新工程实验室，甘肃 兰州 730070； 2 农业部西北旱作马铃薯科学观测实验站，甘肃 渭源 748201)

随着马铃薯主粮化战略的推进，马铃薯种植面积日益扩大。然而，随着中国产业结构的调整，大量农村青壮年劳动力向非农产业转移，传统的人工锄草越来越不现实，草害问题越来越突出，严重影响了马铃薯的产量和品质[1-2]，化学除草已成为现代农业中不可缺少的管理手段和我国广大农业生产者所依赖的除草方式[3-4]。研究发现实践中化学除草存在一定的不足，一方面，杀草谱广、活性高的除草剂大多缺乏选择性，在杀灭杂草的同时可能对本田作物产生药害，影响作物品质及产量[5-7]；另一方面，选择性强的除草剂只能防治少数杂草，不能兼治田间多种杂草，达不到理想的防治效果[8]。通过转基因技术使农作物获得对广谱灭生性除草剂的抗性，不仅可以克服除草剂的选择性，提高除草效果，降低除草成本，而且可以增加作物的安全性[9]。因此，为了更有效地发挥除草剂对杂草的防除作用及解决除草剂使用过程中出现的负面问题，耐广谱灭生性除草剂转基因作物的推广种植可能成为我国农业生产的必然选择和确保我国粮食安全的战略需求[10]。

草铵膦是继草甘膦之后又一性能优良的灭生性除草剂，其在土壤中的半衰期为3～7 d[11]，具有活性高、毒性低、易分解、残留低和环境兼容性好等特点，可防治对草甘膦和百草枯有抗性的顽固杂草[12]，且长期使用的环境安全也得到了肯定[13-14]，具有良好的应用前景。草铵膦的抗性基因Bar来自土壤吸水链霉菌，它编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase，PAT)，PAT使膦丝菌素(phosphinothricin，PPT)的自由氨基乙酰化从而对PPT解毒，使之不能抑制谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的活性[15]。目前，马铃薯转化Bar基因获得草铵膦抗性的研究已有相关报道[16-18]，但多是将Bar基因作为筛选标记基因用于筛选阳性植株，或作为目的基因进行转化，且仅限于试管苗抗性分析，尚缺乏阳性植株对草铵膦耐受性分析的报道。抗除草剂转基因作物对目标除草剂耐受性有一定限度，施药剂量、施药时期或施药方式不当均会对作物产生不同程度的药害，甚至会影响作物的品质和最终产量[19-21]。为此，本试验选用陇薯3号转Bar基因抗草铵膦马铃薯为研究对象，探究苗期喷施不同剂量的草铵膦对药后不同时期杂草的数量，马铃薯生长、生理指标，成熟期马铃薯块茎营养品质和单株产量的影响，考察成熟期土壤和块茎中草铵膦的残留情况，以明确草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯田间杂草的防效及对马铃薯和环境的安全性，为草铵膦的科学使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗草铵膦转基因马铃薯由甘肃省农业科学院马铃薯研究所种质资源与生物技术研究室提供。供试草铵膦为10%水剂，由河北威远生化农药有限公司生产；草铵膦喷施器具为HD400背负式电动喷雾器(河北威远生化农药有限公司)。

1.2 试验设计

试验于2018年在甘肃省农业科学院兰州试验地隔离区进行。试验共设4个处理，即于马铃薯出苗后20 d(2018年6月22日)分别喷施有效成分为0(清水对照，G0)、847.5(G1)、1 271.25(G2)和1 695(G3)g·hm-2的草铵膦，用水量均为 450 kg·hm-2。每个处理 3 次重复，小区面积15.44 m2(行长4.6 m，6行区，小区宽3.36m)，采用随机区组排列，小区之间设隔离带，宽度为1 m。小区间实行定向茎叶喷雾处理，喷雾周到均匀。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 马铃薯农艺性状和产量调查 分别于施药后30和45 d，每小区随机选择6株马铃薯，采用尺子测量植株株高[22](植株地上部分茎基部到生长点的高度，cm)；采用数显游标卡尺紧贴土壤层测量茎粗，每株植株从正面和侧面两个方向测量，用平均值表示植株的茎粗(mm)[22]；根茎叶干重(g)采用烘干法测定，即测完鲜重(g)后，于105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重。成熟期(10月2号)收获的马铃薯块茎按小区进行产量测定。

1.3.2 马铃薯生理指标和块茎品质的测定 分别于施药后1、4、11和20 d统一采集倒数第4片完全展开的叶片带回实验室进行生理指标的测定；收获时每小区筛选长势一致的马铃薯3株，每处理共计9株，分别装袋带回实验室，用水冲洗表面泥土等杂质，晾干后用于干物质、淀粉、还原糖、维生素C和粗蛋白含量等品质性状的测定。

参照钟鹏等[23]的方法测定丙二醛(malondialdehyde, MDA)和游离脯氨酸(proline，Pro)含量；参照唐鑫华等[24]的方法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；参考李雪等[25]的方法测定过氧化氢酶(catalase，CAT)活性。

参照GB 5009.3-2016[26]采用直接干燥法测定干物质含量；参照NY/T 11-1985[27]采用旋光法测定淀粉含量；参照GB/T 5009.7-2016[28]采用直接滴定法测定还原糖含量；参照GB/T 5009.86-2016[29]采用荧光法测定维生素C含量；参照GB 5009.5-2016[30]采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量。

1.3.3 草铵膦的除草效果和对马铃薯药害的调查 施药后15 d，肉眼观察不同浓度草铵膦对杂草防治效果；分别在施药后30和45 d，每小区按对角线取面积为1 m2的3个点，统计每个点的杂草数目，施药后45 d统计完杂草数目后，整株拔出杂草并称量地上部分的鲜重，按照公式分别计算杂草株防效(%)和鲜重防效(%)：

株防效=(对照区杂草株数-处理区杂草株数)/对照区杂草株数×100%

(1)

鲜重防效=(对照区杂草鲜重-处理区杂草鲜重)/对照区杂草鲜重×100%

(2)。

分别于药后1、4、11和20 d, 对马铃薯表型进行仔细观察，调查草铵膦是否对马铃薯造成药害以及药害症状。药害症状参照马国兰等[31]的方法进行描述。

1.3.4 土壤和马铃薯块茎中草铵膦残留测定 收获时，采集各小区的土壤和马铃薯块茎，送至江苏安舜技术服务有限公司，参照GB 23200.108-2018[32]采用LC-MS法进行草铵膦残留检测。

1.4 数据分析

采用 Microsoft Office Excel 2010整理数据；DPS V3.01软件进行单因素方差(One-way analysis，ANOVA)统计分析；Duncan’s 法分析试验结果的差异显著性。所有数据均为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯生长的影响

由表1可知，与喷施清水对照(G0)相比，施药后30 d各施药处理的马铃薯苗均生长正常，未出现任何不良表现，说明试验剂量的草铵膦对马铃薯没有产生明显药害。药后30 d，各处理组马铃薯平均株高为58.28～64.44 cm，平均茎直径为9.54～10.49 mm，根茎叶的平均株鲜重为192.81～239.08 g，根茎叶的平均株干重为21.95～27.76 g。各处理间平均株高和茎直径存在差异，但均未达到显著水平。各剂量草铵膦处理的根茎叶鲜重、干重差异不大，但均显著高于清水对照(G0)。

表1 施药后30 d不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯生长的影响Table 1 Effects of different concent glufosinate on growth of transgenic glufosinate-resistant potato on 30 days after spraying glufosinate

注: 同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.

由表2可知，施药后45 d，各处理马铃薯平均株高为63.17～67.39 cm，平均茎直径为9.90～10.71 mm，根茎叶的平均株鲜重为205.50～239.87 g，根茎叶的平均株干重为22.97～31.47 g，收获时各处理区马铃薯平均单株产量为415.13～649.77 g。各处理间株高和茎直径的差异均未达到显著水平；各施药处理间的根茎叶鲜重、干重无显著差异，但均显著高于清水对照(G0)。收获时单株产量依次表现为G3(649.77 g)>G2(610.08 g)>G1(558.82 g)>G0(415.13 g)，各施药处理的单株产量随着草铵膦浓度的增大而显著增加，且均显著高于清水对照(G0)。

因此，施药后30 和45 d，试验剂量的草铵膦对抗草铵膦马铃薯的生长发育并无负面影响，与清水对照(G0)相比，试验剂量草铵膦均可以显著提高单株产量。

表2 施药后45 d时不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯生长和收获时单株产量的影响Table 2 Effects of different concent glufosinate on growth of transgenic glufosinate-resistant potato on 45 days after spraying glufosinate and per plant yield at harvest time

2.2 不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯块茎营养品质的影响

由表3可知，收获后各处理马铃薯块茎平均淀粉含量为16.24%～16.93%，平均干物质含量为17.83%～18.85%，平均粗蛋白含量为2.52%～2.68%，平均还原糖含量为0.42%～0.48%，平均维生素C含量为15.41～15.86 mg·100g-1。各处理间各指标的差异均未达到显著水平，说明试验剂量的草铵膦对抗草铵膦马铃薯的块茎营养品质未造成明显的负面影响。

表3 不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯块茎营养品质的影响Table 3 Effects of different concent glufosinate on nutritional quality in tuber of transgenic glufosinate-resistant potato

2.3 不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯叶片生理指标的影响

由图1可知，施药后1～20 d，Pro含量随着施药时间的延长呈先降低后升高的趋势，而MDA含量呈先升高后降低的趋势，相同时期下，各处理的马铃薯叶片Pro和MDA含量均不存在显著性差异。

注：不同小写字母表示施药后同一时间下各处理间差显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treaments at the same time after spraying glufasinate(P<0.05). The same as following.图1 不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯叶片Pro含量和MDA含量的影响Fig.1 Effects of different concent glufosinate on concent of Pro and MDA in leaves of transgenic glufosinate-resistant potato

图2 不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯叶片CAT活性和SOD活性的影响Fig.2 Effects of different concent glufosinate on activity of CAT and SOD in leaves of transgenic glufosinate-resistant potato

由图2可知，施药后1～20 d，CAT活性随着施药后时间的延长呈先升高后降低再升高的趋势，SOD活性呈降低的趋势(除G3外)。施药后1和11 d，与清水对照(G0)相比，施药处理的马铃薯叶片CAT活性均无明显差异；施药后4和20 d时，各处理的CAT活性有差异，但未达到显著水平。施药后1 d，与G0相比，施药处理马铃薯叶片SOD活性均无明显差异；施药后4和11 d，G3处理叶片SOD活性显著高于其他处理，但G1、G2与G0间均无显著差异；施药后20 d时，G3处理叶片SOD活性基本恢复到正常水平，与其他处理间无显著差异。表明喷施试验剂量的草铵膦对抗草铵膦马铃薯叶片的Pro和MDA含量、CAT和SOD活性均无显著影响。

2.4 不同浓度草铵膦对抗草铵膦转基因马铃薯田行间杂草的防治效果

在试验地块中杂草种类较多，主要包括阔叶杂草马齿苋(PortulacaoleraceaL.)、灰藜(ChenopodiumglaucumL.)、田旋花(ConvolvulusarvensisL.)、荠菜(Capsellabursa-pastorisL. Medic.)、反枝苋(AmaranthusretroflexusL.)、刺儿菜(CirsiumsegetumBungeeL.)和苣荬菜(SonchusbrachyotusDC)；禾本科杂草狗尾草(SetairaviridisL. Beauv.)、牛筋草(EleusineindicaL. Gaertn.)、旱稗(Echinochloahispidula(Retz.) Nees.)和野燕麦(AvenafatuaL.)。本研究没有按杂草名称逐一列举，而是按照阔叶杂草和禾本科杂草两大类进行统计调查。

由表4可知，施药后30 d，各处理对阔叶杂草的平均株防效为39.75%～72.42%，株防效依次表现为G3(72.42%)>G2(58.26%)>G1(39.75%)；对禾本科杂草的平均株防效为54.30%～82.89%，株防效依次表现为G3(82.89%)>G2(64.44%)>G1(54.30%)。无论是阔叶杂草还是禾本科杂草，3个不同施药剂量对杂草的株防效差异性均达到极显著水平(P<0.01)，且随着施药剂量的增加株防效极显著增加。施药后45 d，各处理对阔叶杂草的平均株防效为31.90%～70.26%，株防效依次表现为G3(70.26%)>G2(56.00%)>G1(31.90%)；对禾本科杂草的平均株防效为52.51%～80.00%，株防效依次表现为G3(80.00%)>G2(62.43%)>G1(52.51%)。施药后45 d各处理对阔叶杂草的平均鲜重防效为39.51%～86.64%，鲜重防效依次表现为G3(86.64%)>G2(54.78%)>G1(39.51%)；对禾本科杂草的平均鲜重防效为61.24%～85.23%，鲜重防效依次表现为G3(85.23%)>G2(70.34%)>G1(61.24%)，即G3对各类杂草的株防效和鲜重防效极显著高于其他2个处理(P<0.01)。

表4 不同浓度草铵膦对转基因抗草铵膦马铃薯田间杂草的防治效果Table 4 Control effect of different concent glufosinate to weeds in field of transgenic glufosinate-resistant potato

注: 不同小写字母表示不同施药剂量间差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示不同施药剂量间差异极显著(P<0.01)。

Note: Different lowercasec letters mean significant difference among different dasages of glufosinate at 0.05 level. Different capital letters mean extremely significant difference among different dasages of glufosinate at 0.01 level.

2.5 土壤和马铃薯块茎中的草铵膦残留分析

由表5可知，各处理的土壤和块茎中草铵膦的检出量均小于规定量，未检出草铵膦，表明试验剂量的草铵膦均可以用于抗草铵膦转基因马铃薯田间杂草的防治，不会产生农药残留危害。

3 讨论

20世纪90年代转基因作物开始商业化种植以来，关于抗除草剂转基因作物田目标除草剂施用的研究也随即展开，除草剂施用时间和施用剂量已成为研究热点[33-36]。本研究中，在出苗20 d时，分别用含有效成分0、847.50、1 271.25、1 695.00 g·hm-2草铵膦药剂定向喷施杂草和转基因抗草铵膦马铃薯茎叶，从安全性来看，各药剂定向喷雾施用于转基因抗草铵膦马铃薯未产生明显的药害症状，与清水对照相比，收获时各供试浓度均表现出明显的增产作用，这与杨益善等[33]关于幼苗期喷施150～750 g·hm-2草铵膦对耐除草剂水稻产生药害并产量呈下降趋势的研究结果不同，这种差异可能与供试作物不同有关。即使在常规剂量下，除草剂对作物也是一种胁迫，有些作物表观上无明显的药害症状，但是这种胁迫可能会引起作物体内生理特性的复杂变化[37]。本研究中，除根茎叶鲜干重显著高于清水对照外，各处理马铃薯叶片的MDA和Pro含量、CAT活性，在药后各时期与清水对照无显著差异；药后4和11 d，G3处理叶片SOD活性虽显著高于其他处理，但药后20 d时，G3叶片基本恢复到正常水平，与其他处理间无显著差异。各施药处理的马铃薯株高、茎直径和薯块营养品质与清水对照也无显著差异，说明试验剂量的草铵膦对马铃薯生理生化特性影响不大，这与姜伟丽等[34]的研究结果一致。

表5 草铵膦残留检测结果Table 5 Test results of glufosinate residues

从防治效果来看，综合施药后30和45 d结果，与清水对照相比，3种剂量的草铵膦对杂草均达到显著防除效果，其中仅G3处理(有效成分1 695.00 g·hm-2)对阔叶杂草的平均株防效达到70%以上，对禾本科杂草的平均株防效达80%以上，其他处理对两类杂草的株防效均在70%以下；G3处理(有效成分1 695.00 g·hm-2)对两类杂草的平均鲜重防效均达85%以上，说明有效成分1 695.00 g·hm-2草铵膦药剂对转基因抗草铵膦马铃薯田行间杂草的防治效果最佳。因此，采用1 695.00 g·hm-2草铵膦药剂可以有效防除转基因抗草铵膦马铃薯田行间杂草，既不会对马铃薯造成药害，也不会产生农药残留危害。草铵膦对抗草铵膦作物安全剂量可高达2 000 g·hm-2以上，使用高剂量草铵膦对转基因作物有一定的伤害，但对产量影响不大[19，35]。本研究仅在转基因抗草铵膦马铃薯的苗期，选择推荐使用量的高、中、低剂量对马铃薯和田间杂草进行茎叶喷雾，调查草铵膦对田间杂草防治效果，同时分析了草铵膦对马铃薯及环境的安全性。而关于草铵膦对其他生育时期田间杂草的防除效果及马铃薯对更高剂量草铵膦的耐受性还有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，在转基因抗草铵膦马铃薯的苗期，喷施不同剂量(1 695、1 271.25和847.5 g·hm-2)的草铵膦对杂草都有一定的防除效果，其中含有效成分1 695 g·hm-2的草铵膦对杂草的防治效果最好，株防效和鲜重防效均达70%以上。各剂量草铵磷不仅没有对马铃薯造成药害，在土壤和马铃薯块茎中也没有残留，而且可以明显提高马铃薯的单株产量。综上，在转基因抗草铵膦马铃薯的苗期，为了安全高效地防除杂草，可以用含有效成分1 695 g·hm-2的草铵膦进行茎叶喷雾。