三角帆蚌dPGAM基因的克隆与表达分析

应晨怡 谢陈南 张根芳 周 淼 许海方 黄芸洁 陈旭旭 杨受保,*

(1 绍兴文理学院生命科学学院，浙江 绍兴 312000；2 金华职业技术学院农业与生物工程学院，浙江 金华 321007；3 诸暨市水产技术推广站，浙江 诸暨 311800)

磷酸甘油酸变位酶(phosphog1ycerate mutase, PGAM)是糖酵解和糖异生途径中催化3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸之间相互转化反应的一种糖酵解酶[1]。根据催化反应中对辅因子2,3-二磷酸甘油酸的依赖关系，PGAM可分为辅因子依赖型(cofactor-dependent PGAM, dPGAM)和非依赖型(cofactor independent PGAM，iPGAM)，其中dPGAM属于酸性磷酸酶超家族，通常以单体、二聚体或四聚体的形式存在于脊椎动物、大部分无脊椎动物、某些真菌和细菌中；其单体分子由近250个氨基酸组成，分子量近27 kDa；iPGAM属于碱性磷酸酶超家族，以约500个氨基酸组成的近60 kDa的单体形式存在于植物、部分无脊椎动物、某些真菌和细菌中[2-4]。研究发现，PGAM与碳水化合物转运、新陈代谢调节和生长发育等有关[5]。如猪的PGAM2基因定位于染色体18 q11.3-q12[6]，该区域存在与瘦肉率、肌纤维直径、肌肉的产量及质量相关的数量性状定位(quantitative trait locus，QTL)[7-8]；猪PGAM2主要在骨骼肌、心肌等肌肉组织中表达，且在肌肉发育的各个阶段均呈高水平表达，在肌肉发育和生长过程中有重要作用[9]；猪PGAM2在细胞质和细胞核内均有定位，参与胞质和胞核内的糖代谢过程[6]。而人PGAM在多种肿瘤细胞中高表达，PGAM基因沉默可有效抑制乳腺癌、前列腺癌等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[10-12]。此外，PGAM在弓形虫侵入的过程中，不仅与弓形虫的新陈代谢及生长发育呈正相关，在宿主中的表达水平也明显增强[13-15]。上述研究表明，PGAM在有机体能量代谢中发挥着重要作用，广泛参与新陈代谢、生长发育、肿瘤、病原与宿主相互作用等生物学过程。

目前在细菌、真菌、无脊椎动物吸虫、脊椎动物等不同进化地位的生物中，已有关于PGAM及其功能的研究报道[15-21]，但在无脊椎动物贝类中仅有太平洋牡蛎PGAM的序列相关信息(GenBank序列号：EKC26210)[22]，关于PGAM基因在贝类生物生长发育、免疫防御反应过程中功能的研究尚未见报道。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我国特有的淡水珍珠养殖蚌种[23]，其生产的珍珠占世界淡水珍珠总产量的80%以上，但由于淡水无核珠大多为个体小、形状不规则、颜色各异的劣质珠，导致我国淡水珍珠产值仅占国际总贸易额的5%左右[24-26]。因此，利用经选育的产纯色珍珠的育珠蚌，结合分子标记开展辅助育种，选育生长快、产纯色珍珠的育珠蚌，能有效促进我国淡水珍珠养殖业的可持续发展。本研究从三角帆蚌中克隆了PGAM基因的全长cDNA序列，并对该基因在紫色家系三角帆蚌和黄色家系三角帆蚌不同组织中的转录表达以及在贝类抗感染免疫反应中的功能作用进行分析，以期为深入探讨PGAM基因在三角帆蚌生长发育中的功能，并以该基因为分子标记，为开展三角帆蚌的选择育种提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

三角帆蚌为经选育的产紫色珍珠家系(紫色蚌)和黄色珍珠家系(黄色蚌)个体，平均体重约50 g，取自浙江省金华市威旺养殖新技术有限公司。试验前在经曝气的水族箱中养殖7 d，养殖期间投喂小球藻。每箱水的体积为100 L，水温为22.0±1.0℃。

以紫色家系三角帆蚌蚌为材料，5只蚌为1组，每组设3次生物学重复，分别用注射器自闭壳肌注射100 μL嗜水气单胞菌悬液(5×107cfu·mL-1)，对照注射100 μL 0.6%生理盐水[23-24]。于诱导刺激0(CK)、12、24、48和72 h后，分别用一次性注射器从三角帆蚌围心腔中抽取血淋巴液，转入无菌、经焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理并预冷的1.5 mL离心管中，于4℃条件下800 r·min-1离心5 min，得到三角帆蚌血淋巴细胞。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取和反转录 分别取紫色系和黄色系三角帆蚌的鳃、外套膜、闭壳肌、消化腺、性腺组织、血淋巴细胞。按照TRIzol试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]说明书抽提各组织的总RNA；参照反转录试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]说明书进行反转录，获得cDNA模板。

1.2.2 全长序列克隆 以绍兴文理学院贝类育种实验室之前构建的三角帆蚌全长cDNA文库中获得的PGAM基因部分cDNA序列(未发表)为基础，设计5′RACE引物HCPGAM5′R(5′-C T C A G A C T G T T A C C A T G T G C A G CA-3′)和3′RACE引物HCPGAM3′F (5′-C T C C A C C A C C A C T G G A G C C T AC-3′)，利用HCPGAM5′R和HCPGAM3′F分别和试剂盒(Clontech，USA)自带的通用引物(universal primer，UPM)分别配对，用于扩增三角帆蚌PGAM基因的5′和3′端序列。5′和3′-RACE PCR操作步骤与参数参照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit [Clontech，USA]说明书进行。扩增得到的片段经回收纯化后与pGM-T载体[天根生化科技(北京)有限公司]连接，然后转化至大肠杆菌JM109[TAKARA(日本)]感受态细胞中，经PCR鉴定为阳性克隆后送至杭州擎科生物公司测序；所得序列经BLAST在线比对确认为所需的PGAM基因cDNA序列。

1.2.3 序列比对与进化分析 利用NCBI数据库中的BLAST(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast)和Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行HcdPGAM基因的序列比对和同源性分析[27]；利用NCBI数据库中的ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)和Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan)进行开放阅读框和功能域预测；利用Mega 7.0软件中的邻接(Neighbor-joining)法构建系统进化树。

1.2.4 组织分布与表达 利用实时荧光定量PCR检测各组织中PGAM基因的表达情况[24]。反应体系为25 μL，其中含SYBRPremixExTaq(2×) 12.5 μL，cDNA 模板1.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL。PCR反应程序：95℃预变性3 min，95℃变性20 s， 56℃退火40 s。以β-actin基因作为内参基因(GenBank序列号：HM045420.1)。所用引物为: PGqf (5′-G T G G C T G G T T T G A T G C A GA-3′)和PGqr (5′-T C T T T A C T T G T G C T T C T C CA-3′)；ActRT-f (5′-G A T G A T A T G G A G A A G A T C TG-3′)和ActRT-r (5′-C A T C A C C A G A G T C T A A G A CA-3′)，采用2-ΔΔCt法[28]计算基因相对表达量。

1.3 数据分析

采用软件SPSS 20.0对试验数据进行单因素方差分析(one-way，ANOVA)，结果以mean±SD表示，P<0.05表示存在显著性差异，P<0.01表示存在极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 三角帆蚌HcdPGAM的克隆、序列特征与系统进化分析

利用获得的三角帆蚌PGAM基因部分cDNA序列，经PCR扩增，获得长度约750 bp片段(图1)。经克隆、测序比对，三角帆蚌PGAM基因的cDNA全长为1 470 bp (GenBank序列号：MH410486)，含有1个长度为750 bp的开放阅读框，编码250个氨基酸的假定蛋白，该蛋白的预测等电点和相对分子质量分别为7.10和28.66 kDa，属于dPGAM，因此命名为HcdPGAM。在起始密码子ATG的上游为16 bp非翻译区，终止密码子TGA的下游为701 bp的非编码区(图2)，并含有1个由226个氨基酸组成的组氨酸磷酸酶结构域(histidine phosphatase domain，5～230 aa)。

注：L1: 5′端扩增产物；L2: 3′端扩增产物。Note: L1: Product of 5′RACE-PCR products. L2: Product of 3′RACE-PCR products.图1 HcdPGAM基因5′和3′RACE-PCR产物凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis pattern of 5′ and 3′ RACE-PCR products of HcdPGAM gene

同源性比对结果显示，三角帆蚌HcdPGAM的氨基酸全序列总体上与所选取的各种生物PGAM蛋白的相似性在58.8%～82.0%之间(图3、图4)，其中与太平洋牡蛎(Crassosteagigas，GenBank序列号：EKC26210)的相似性最高，为82.0%；其次为加利佛利亚海兔(Aplysiacalifornica，GenBank序列号：XP_005089803)，相似性为73.6%；与中华蜜蜂(Apiscerana，GenBank序列号：NP_012770.1)相似性最低，为58.8%。同时，三角帆蚌HcdPGAM与其他生物的组氨酸磷酸酶结构域的序列相似性均在58.7%以上，总体上与全序列相似性数值相近(图3)。

利用MEGA 7.0软件构建PGAM蛋白的系统进化树，结果表明，三角帆蚌HcdPGAM与太平洋牡蛎的dPGAM蛋白进化关系最近，并与海兔等无脊椎动物dPGAM蛋白聚为一支(图4)，而与脊椎动物及昆虫的dPGAM蛋白序列的进化关系较远。综上，本研究所获得的三角帆蚌HcdPGAM为dPGAM蛋白亚家族的一个新成员。

注：左侧数字为核苷酸和氨基酸的数量。3′端含有的多腺苷酸加尾信号用下划线标出。Note：The nucleotides and amino acids are numbered along the left margin. The classical polyadenylation signals in the 3′ UTR is underlined.图2 三角帆蚌HcdPGAM基因的核苷酸和氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of HcdPGAM gene from H.cumingii

图3 HcdPGAM氨基酸序列的比对分析Fig.3 Multiple alignment of the amino acid sequences for HcdPGAM

图4 HcdPGAM氨基酸序列的进化分析Fig.4 Multiple alignment of the amino acid sequences for HcdPGAM

2.2 三角帆蚌HcdPGAM基因的组织表达分析

实时荧光定量PCR检测结果显示，HcdPGAM在紫色系和黄色系三角帆蚌鳃、外套膜、闭壳肌、消化腺、性腺和血淋巴6种组织中均有表达，但同一家系的不同组织间，以及不同家系之间的表达水平均存在差异。紫色系三角帆蚌中，HcdPGAM在性腺(8.10倍)中表达水平最高，其次为闭壳肌(6.28倍)和腮(4.11倍)，在消化腺(2.66倍)、外套膜(1.63倍)和血淋巴细胞(1.23倍)中表达水平相对较低；而黄色系蚌中，HcdPGAM在性腺(7.78倍)中表达水平也最高，其次为闭壳肌(3.54倍)和腮(3.30倍)，在消化腺(2.47倍)、外套膜(2.05倍)和血淋巴细胞(1.35倍)中表达水平相对较低。紫色系和黄色系三角帆蚌相同组织间的比较结果显示，紫色系蚌的性腺、闭壳肌、腮和消化腺中HcdPGAM表达水平均高于黄色系，尤其是闭壳肌中，紫色系蚌的HcdPGAM的表达水平显著高于黄色系(P<0.05)；而外套膜和血淋巴细胞中HcdPGAM的表达水平则低于黄色系蚌，2个家系其他相同组织之间表达水平的差异均不显著(图5)。

注：*表示在0.05水平差异显著。**表示在0.01水平差异显著。下同。Note: * indicates significant difference at 0.05 level. ** indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.图5 HcdPGAM在三角帆蚌不同组织中的表达Fig.5 Expression of HcdPGAM in various tissues of H.cumimgii

2.3 嗜水气单胞菌诱导刺激下三角帆蚌HcdPGAM基因的表达量

为分析三角帆蚌血细胞中HcdPGAM基因在抗病原菌感染的天然免疫反应中的功能作用，以紫色家系三角帆蚌为材料，在嗜水气单胞菌诱导刺激不同处理时间分别取样，进行实时荧光定量PCR分析。由图6可知，随着处理时间的延长，HcdPGAM的表达水平呈先升高后降低的趋势，嗜水气单胞菌诱导刺激12 h后，HcdPGAM表达水平明显升高，至24和48 h时，均极显著高于CK，随后其表达水平下降，至72 h时表达量与CK间无显著差异。由此可见，嗜水气单胞菌诱导刺激可调节三角帆蚌HcdPGAM的表达水平，即HcdPGAM基因在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫相关能量代谢过程中可能发挥重要作用。

图6 嗜水气单胞菌诱导对三角帆蚌HcdPGAM基因表达的影响Fig.6 Effect of Aeromonas hydrophila challenge on the expression of HcdPGAM

3 讨论

PGAM是糖酵解和糖异生途径中的关键酶系之一，在碳水化合物转运、新陈代谢调节和生长发育等方面发挥着重要的作用[5,29]。本研究克隆了三角帆蚌的PGAM基因的cDNA序列，分析发现该序列包括1个750 bp的开放阅读框，编码1个含250个氨基酸、分子质量近28.66 kDa的假定蛋白，并含有1个保守的由247个氨基酸组成的组氨酸磷酸酶结构域。三角帆蚌PGAM的全长氨基酸序列或组氨酸磷酸酶结构域，与各种不同进化地位动物中该蛋白的氨基酸序列相似性均在53%以上。系统进化分析结果也显示，三角帆蚌PGAM与无脊椎动物PGAM蛋白聚为一支，而与脊椎动物进化上相距较远。上述结果均表明，本研究所克隆的HcdPGAM具有与其他生物dPGAM蛋白高度相似的分子量大小、序列与结构特征。

前人研究表明，在芽孢杆菌等细菌和秀丽线虫中，通过RNAi技术降低PGAM的活性，会导致机体出现形态异常、发育异常等现象[17-18,21]。猪PGAM2主要在骨骼肌和心肌等肌肉组织中表达，在猪胚胎骨骼肌发育过程中(妊娠33～90 d)呈差异性表达，与骨骼肌的发育有关；且在通城猪(中国地方猪种)和长白猪(瘦肉型猪)骨骼肌发育的不同时期呈规律性表达，说明PGAM2可能与猪的产肉性状有关[9]。此外，PGAM在多种人类来源的肿瘤细胞中也高水平表达，是1个潜在的肿瘤标志物及治疗靶点[30-32]。综上表明，PGAM可作为在机体能量代谢、细胞增殖、骨骼肌及个体生长发育等研究中的分子标记。

实时荧光定量PCR检测结果显示，HcdPGAMmRNA在紫色蚌和黄色蚌的6种组织(鳃、外套膜、闭壳肌、消化腺、性腺和血淋巴细胞)中呈组成性表达；2个家系中性腺、闭壳肌和腮组织均呈现较高的表达水平，表明HcdPGAM在这3个组织中具有重要作用。

腮是参与贝类代谢与免疫的主要器官之一，在摄食、代谢和防御外界异物入侵等方面发挥着重要的作用，本研究中HcdPGAM的高水平表达说明HcdPGAM在腮摄食、代谢和免疫防御等过程中发挥重要作用。而闭壳肌不仅与贝壳的开张有关，还可以借其有节律的收缩控制外套腔内水的交换，HcdPGAM的表达量可能与三角帆蚌闭壳肌生长发育以及运动过程中能量代谢有关。2个家系蚌相同组织间比较结果显示，紫色蚌性腺、腮和消化腺中的HcdPGAM基因表达水平明显高于黄色蚌，这可能与2个家系蚌的性腺发育不同步，对能量需求高低不一致有关。紫色蚌中闭壳肌组织的表达水平显著高于黄色蚌，表明紫色蚌中具有更高的能量代谢水平，即紫色蚌可能比黄色蚌更具生长优势，这一点在育珠生产实践已被证实。研究表明，闭壳肌是贝类选择育种及定向培育中常用的指标之一[33]，HcdPGAM基因在三角帆蚌闭壳肌中的表达模式，表明HcdPGAM不仅与三角帆蚌上述3个组织中高水平的能量代谢需求有关，同时也与其生长发育有关，该基因可以作为贝类分子辅助育种的潜在的标记。下一步的研究方向可结合其他生长、生产性状，对育珠蚌同一家系不同世代及不同家系相同世代之间，进行HcdPGAM基因的表达情况分析。

有研究发现在寄生虫侵入过程中不仅寄生虫中PGAM的表达水平增强，宿主PGAM基因的表达水平也明显提高[14-15]。本研究也发现，嗜水气单胞菌诱导刺激处理可极显著上调HcdPGAM基因的表达水平，证明HcdPGAM基因在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫相关能量代谢过程中也发挥着重要的作用。

4 结论

本研究结果表明，HcdPGAM与三角帆蚌的能量代谢和生长发育有关，且在三角帆蚌抗细菌感染的天然免疫相关能量代谢过程中也发挥着重要作用，但将其作为分子标记运用于贝类辅助育种仍有待进一步研究。本研究结果为深入探讨PGAM基因在三角帆蚌中的功能，以及为筛选三角帆蚌不同颜色家系间的特异性分子标记提供了一定的理论依据。