姜黄素对过度训练所致大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

郭爱民,李亚俊,曹 卉,周海涛,曹建民,胡 戈,牛衍龙,任 奕

(1.中国石油大学(北京),北京 102249;2.中南大学,湖南长沙 410083;3.北京体育大学,北京 100084;4.北京联合大学,北京 100023;5.北京联合大学,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100191;6.赣南医学院,江西赣州 341000)

科学、合理的运动训练可以有效促进心脏形态结构可调节性和生理性重塑,改善心脏功能,提高生活质量和健康水平[1]。竞技体育中常以长时程、高强度训练刺激机体以提高运动员运动能力和竞技水平,受运动负荷、训练周期、恢复时间等多重因素影响,运动员常出现过度训练综合症并诱发多器官出现病理改变和功能紊乱[2]。长时程、高强度运动时,各器官血流量发生急剧变化,尤其是心脏,需氧量显著增加,氧自由基的产生随之增加,抗氧化能力减弱[3-4]。在低浓度时,氧自由基在细胞内信号传导和调节过程中起着“氧化还原信使”的作用[5],但过量氧自由基会加剧氧化应激反应,引起蛋白质和脂质过氧化以及DNA损伤,诱发凋亡信号,导致心肌细胞出现不可逆转的损伤和死亡[6],与心脏功能紊乱、心血管疾病的发生密切相关[7]。由此可见,长时程、高强度运动引发的氧化应激增强,是诱发运动性心肌损伤的主要原因。

细胞凋亡在过度训练引发的运动性心肌损伤中发挥了重要的作用[8]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是细胞氧化应激反应中的关键转录因子,受kelch样ECH相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)调控。Nrf2通过识别靶基因启动子中的抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element,ARE),调节下游众多抗氧化酶的基因表达,发挥抗氧化作用,从而抵抗氧化应激。Nrf2也可与B淋巴细胞瘤因子-2(B cell lymphoma-2 protein,Bcl-2)抗氧化反应元件结合,通过上调Bcl-2表达,下调Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)表达,阻止细胞凋亡[9]。姜黄素是从姜科、天南星科中的部分植物根茎中提取的一种天然色素,作为世界卫生组织批准的天然食品添加剂及我国最早批准使用的天然色素之一,被广泛应用于食品工业[10]。姜黄素作为一种多酚类化合物,具有抗氧化、抑炎及抑制肿瘤生长等药理作用,其在医学界的应用已得到越来越多的重视,在抗癌、抗炎、预防老年痴呆等多个领域发挥了重要作用。姜黄素可以直接使Nrf2上丝/苏氨酸残基发生磷酸化,促进Nrf2核易位[11],促进Nrf2与ARE的结合,诱导血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达增加[12],抑制氧化应激反应。Keap1蛋白上的三个反应性半胱氨酸残基Cys-151、Cys-273和Cys-288,能够与亲电子化合物共价结合[13],姜黄素中的酚羰基可以与半胱氨酸残基上的巯基发生加成反应,促使Nrf2-Keap1解偶联,从而促进Nrf2的核转位[14]。姜黄素作为一种抗氧化剂,具有酚羟基和β-二酮2个活性部位,均可以提供质子,直接参与阻断自由基的反应[15]。本团队前期研究表明姜黄素对过度训练引发的大鼠肾脏组织结构和功能损伤均具有保护作用,其机制与减轻凋亡、抑制炎症有关[16-17]。

本实验结合前期研究,通过观察心肌组织病理学的改变,检测心肌损伤标志物,结合心肌组织氧化应激指标以及细胞凋亡水平变化,来探讨姜黄素是否可以通过延缓过度训练所致氧化应激,有效抑制大鼠心肌细胞凋亡的发生,进而发挥对心脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

姜黄素 纯度>99%,陕西源泰生物科技公司;羧甲基纤维素钠 纯度>99%,上海士锋生物科技有限公司;睾酮(testosterone,T)、皮质酮(corticosterone,Cor)放射免疫试剂盒 武汉Servicebio试剂公司;心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、心肌总抗氧化能力(Total antioxidative capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)酶联免疫试剂盒 美国BD公司;TUNEL心肌细胞凋亡测试试剂盒 瑞士Roche公司;Nrf2、HO-1、Bax和Bcl-2的一抗、二抗和DAB显色剂 武汉Servicebio试剂公司;SPF级雄性Wistar大鼠63只 体重(218.4±10.7) g 49 d龄,北京大学医学部实验动物科学部(动物生产合格证编号SCXK(京)2016-0010);基础饲料 北京大学医学部实验动物科学部提供。

Allegra 25R型台式高速离心机 美国Beckman Coulter公司;Wellscan MK3型酶标仪 美国雷博公司;Pannoramic MIDI全自动数字切片扫描系统 匈牙利3D HISTECH公司;r-911型全自动放免计数仪 中国科技大学实业总公司;722型分光光度计 上海分析仪器三厂;NR-B17CC型超低温冰箱 日本松下;ISO9001型电子天秤 北京赛多利斯仪器系统有限公司;DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司;DK-2000-Ⅲ L型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;LEICA RM2016型病理切片机 德国RM公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 动物实验于北京体育大学运动营养实验室完成。实验过程中,实验室温度(22±2) ℃,相对湿度55%～75%,光照时间随正常昼夜节律。大鼠以基础饲料和蒸馏水常规饲养,自由饮食。

63只大鼠首先进行4 d适应性饲养,然后以20 min/d的运动量进行为期3 d的适应性游泳训练,剔除不符合实验要求的3只大鼠后,剩余60只大鼠以数字随机分组法分为3组(直接标号法编号):安静对照组(C组,12只)、过度训练组(OM组,24只)和姜黄素+过度训练组(COM组,24只)。训练结束后,受训练强度、频度、负重情况、恢复时间等因素影响,OM、COM组大鼠出现死亡,分别剩余11只和14只。

1.2.2 营养干预与训练方案 C组常规饲养,不进行任何运动及营养干预。OM、COM组采用8周递增负荷游泳训练,具体方案[18-19]详见图1。姜黄素用0.5%的羧甲基纤维素纳配成混悬液,4 ℃存放备用。训练过程中,对COM组大鼠进行姜黄素营养干预,根据文献及预实验确定姜黄素干预组剂量为200 mg/(kg·d)[20],灌胃体积为5 mL/kg,其余两组灌胃等体积0.5%的羧甲基纤维素纳,采用专业灌胃器每天灌胃一次。

图1 大鼠游泳训练方案

1.2.3 样本采集 末次训练结束24 h后,各组大鼠乙醚麻醉,颈总动脉取血,37 ℃自然凝固,待血清出现后,放入冰箱24 h后,4 ℃、3000 r/min离心10 min,得到上清液即为血清,置-20 ℃冰箱中保存待查。迅速取部分左心室心肌组织浸入4%多聚甲醛固定液中。同时,另取部分左心室心肌组织,置于预冷的生理盐水中洗净血污,准确称量重量后按照1∶9的比例加入PBS缓冲液,以玻璃匀浆器在冰上充分研磨后进行超声破碎。超声在冰浴中进行,功率200 W,单次不超过3 s,根据破碎程度重复2～3次。破碎后经5000 r/min离心5 min取上层清液待测。

1.2.4 指标测试

1.2.4.1 心肌组织形态评价 将心肌组织从固定液中取出,流水洗涤12 h,将组织依次放入75%酒精5 min、85%酒精5 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min 中脱水透明,石蜡包埋,制成4 μm切片,HE染色。在400倍光学显微镜下,进行心肌组织形态评价[21]。

1.2.4.2 血清T、Cor[21]和cTnI[22]的检测 将分装后的各组大鼠的血清按照试剂盒的相关步骤,采用放射免疫法进行血清T和Cor测定,并计算T/Cor比值;采用酶联免疫吸附法进行血清cTnI测定。

1.2.4.3 心肌Nrf-2、HO-1、Bax、Bcl-2表达[21-22]采用免疫组化法检测心肌Nrf-2、HO-1、Bax、Bcl-2蛋白表达。石蜡切片脱蜡至水经抗原修复后,加入3%双氧水溶液室温避光孵育25 min后脱色洗涤3次进行血清封闭,随后加入上述相应蛋白的一抗、二抗,进行DAB显色,Harris苏木素复染细胞核后脱水封片。每张切片随机选择5个高倍视野,每个视野100个细胞,根据细胞核着色程度和范围进行H-score评分评定[23],其中深棕色为强阳性,棕黄色为中度阳性,浅黄色为弱阳性,蓝色细胞核为阴性。H-score=(弱阳性细胞密度×1)+(中阳性细胞密度×2)+(强阳性细胞密度×3)。

1.2.4.4 心肌细胞凋亡指数[22]采用Tunel法检测心肌细胞凋亡水平并计算细胞凋亡指数(H-score)。石蜡切片脱蜡至水,经修复、破膜后,将末端脱氧核苷酸转移酶、脱氧尿苷三磷酸按2∶29比例混合,覆盖组织。切片平放于湿盒内,37 ℃孵育2 h后加入3%过氧化氢溶液,室温避光孵育15 min。在converter-POD液中,37 ℃孵育30 min。洗涤,DAB显色,Harris苏木素复染细胞核后,流水冲洗,将切片依次放入75%酒精5 min、85%酒精5 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min 中脱水,之后将切片拿出晾干,封片。采用Pannoramic MIDI病理切片扫描仪将每张切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值,应用公式计算H-score从而对其进行定量分析。每张切片随机观察5个高倍视野,每个视野100个细胞,其中细胞核呈深棕色为强阳性,棕黄色为中度阳性,浅黄色为弱阳性,蓝色细胞核为阴性。进而对每个组织点进行识别分析出强阳性、中度阳性、弱阳性及阴性的面积(单位:像素)和阳性百分比,最后进行H-score评分评定,H-score=(弱阳性细胞密度×1)+(中阳性细胞密度×2)+(强阳性细胞密度×3)。

1.2.4.5 心肌T-AOC、SOD活性和MDA浓度的检测 将分装后的各组大鼠的血清按照试剂盒的相关步骤,采用酶联免疫吸附法检测T-AOC、SOD活性以及MDA浓度[22]。

1.3 数据统计

所得数据用SPSS 20.0软件进行分析处理,数据以均数±标准差表示,采用Shapiro-Wilk检验对数据进行正态分布检验,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐时采用LSD法,方差不齐采用Tamhane法。p<0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 各组大鼠心肌组织形态

图2显示,C组心肌纤维着色均匀,肌纤维结构清晰,呈短柱状,细胞境界清晰,细胞质呈红色,细胞核呈蓝黑色,且分布均匀。OM组心肌纤维着色明显不均匀,结构不清晰,细胞境界模糊不清,心肌纤维出现肿胀,且有弯曲或断裂现象。COM组心肌纤维着色呈均匀红色,结构与细胞境界清晰,仅见心肌纤维出现轻度肿胀和弯曲。

图2 各组大鼠心肌组织结构变化(HE,400×)

2.2 各组大鼠血清睾酮、皮质酮、肌钙蛋白Ⅰ水平变化

T/Cor比值被认为是监控运动者机能状况的敏感指标,可以有效反映机体合成和分解代谢的平衡情况[24]。以往的研究将T/Cor比值下降30%定为人体过度训练的诊断标准[25]。本研究结果显示(表1),OM组血清T极显著低于C组(p<0.01),血清Cor极显著高于C组(p<0.01);COM组血清T极显著高于OM组(p<0.01),血清Cor显著低于OM组(p<0.01)。组间T/Cor比值变化与T变化相一致,其中OM组大鼠T/Cor比值较C组下降达86.33%,证明本研究成功建立过度训练动物模型。

表1 各组大鼠血清睾酮、皮质酮、肌钙蛋白水平Table 1 Serum testosterone,corticosterone and cardiac troponin I levels between rats in each

cTnI是构成心肌肌钙蛋白的三个亚基之一,仅在心肌中表达。正常情况下游离型cTnI仅在心肌细胞胞浆内少量存在,大部分cTnI则以复合体形式存在[26]。研究表明[26-27],长时程高强度运动可造成心肌出现氧化应激损伤,游离型cTnI迅速从受损细胞滤出造成其在血液中含量升高;同时,随着心肌细胞凋亡增强,cTnI从复合体中分解,大量cTnI被释放到血液循环中,高浓度的cTnI不仅可在运动后即刻出现,甚至可维持到运动后24h。由于cTnI具有高度的特异性和敏感性,其作为反映运动负荷是否造成心肌损伤的生物学标志物已被广泛认可[28]。本研究结果显示(表1),OM组血清cTnI极显著高于C组(p<0.01),COM组显著低于OM组(p<0.05),结合心肌组织形态出现一系列病理学改变,说明8周递增负荷游泳训练致大鼠过度训练并引发运动性心肌损伤,而在训练过程中补充姜黄素可以有效缓解心肌损伤的发生与发展。

2.3 各组大鼠心肌Nrf-2和HO-1表达变化

Nrf2被称为抗氧化反应的“主要调节剂”,是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子,同时也是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者,通过与ARE相互作用,调节下游多种抗氧化基因的表达[29]。HO-1作为Nrf2下游靶标,广泛参与Nrf2介导的抗氧化应答过程[30]。本研究结果显示(表2,图3),OM组心肌Nrf2表达与C组无显著差异(p>0.05),HO-1表达显著低于C组(p<0.05);COM组心肌Nrf2表达极显著高于OM组(p<0.01),HO-1表达显著高于OM组(p<0.05)。这一变化可能是由于长时程、高强度运动抑制了Nrf2和Keap1二聚体的解离过程,阻碍Nrf2进行核易位,导致HO-1表达减少。

图3 各组大鼠心肌Nrf2和HO-1表达情况(TUNEL,400×)

表2 各组大鼠心肌Nrf2和HO-1的H-score结果Table 2 H-score of Nrf2 and HO-1 in myocardium between rats in each

而姜黄素作为Nrf2的激动剂,可以通过诱导Nrf2核易位,增强下游抗氧化基因表达,缓解心肌氧化应激状态。本研究结果表明,补充姜黄素的COM组大鼠心肌组织Nrf2(p<0.01)和HO-1(p<0.05)表达水平极显著/显著高于OM组,这与多项研究结果是一致的。He等[31]的研究发现,姜黄素通过激活Nrf2及HO-1,有效改善高脂肪饮食诱导的小鼠肌肉氧化应激状态。Zhao等[32]的研究中,姜黄素的预处理减弱了氧自由基生成,并显著拮抗LO2肝细胞中葡萄糖氧化酶诱导的脂质过氧化。石瑶等[33]的研究表明,姜黄素通过上调HO-1活性,抑制氧化应激引发的心肌细胞损伤。这表明姜黄素可以通过激活Nrf2通路,上调Nrf2和HO-1表达水平,通过抑制氧化应激减轻细胞损伤。

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡水平及Bax和Bcl-2表达变化

Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的关键调节因子,包括以Bcl-2为代表的抗凋亡蛋白和以Bax为代表的促凋亡蛋白。这些蛋白之间动态平衡的轻微变化参与过度训练诱导心肌细胞凋亡的发生与发展。Bcl-2/Bax比值的变化,决定细胞凋亡发生的走向[35]。本研究结果显示(表3、图4、图5),与C组相比,OM组心肌细胞凋亡水平极显著升高(p<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减弱(p<0.05),促凋亡蛋白Bax表达极显著增强(p<0.01),Bcl-2/Bax比值极显著降低(p<0.01)。上述结果说明,长时程、大强度致过度训练引发氧化应激,Bcl-2/Bax比值降低,过度训练大鼠心肌细胞凋亡加剧,引发运动性心肌损伤。

表3 各组大鼠心肌细胞凋亡水平及Bax和Bcl-2的H-score结果Table 3 H-score of cardiomyocyte apoptosis and Bcl-2/Bax in myocardium between rats in each

图4 各组大鼠心肌细胞凋亡水平(TUNEL,400×)

图5 各组大鼠心肌Bcl-2和Bax表达情况(TUNEL,400×)

本研究还发现,COM组大鼠心肌细胞凋亡水平较OM组极显著降低(p<0.01),Bcl-2表达极显著增加(p<0.01),Bax表达极显著减少(p<0.01),Bcl-2/Bax比值极显著升高(p<0.01)。Calvert等的研究表明[36],提高Nrf2表达的稳定性可以升高Bcl-2水平,说明姜黄素可以通过上调Nrf2表达,改善心肌细胞凋亡状态。Yang等[37]的研究中,使用姜黄素对大鼠心脏进行预处理,发现姜黄素可以通过上调Bcl-2表达、下调Bax表达,减少线粒体氧化损伤,进而改善缺血再灌注后的心肌功能。He等[38]的研究认为姜黄素可以通过促进Bcl-2易位至线粒体,抑制氧化应激,改善线粒体功能,从而降低药物诱导的心肌损伤。本研究中,与OM组相比,COM组大鼠心肌病理学变化明显减轻,血清T/Cor比值极显著升高(p<0.01),cTnI水平显著降低(p<0.05)。结合上述病理特征、损伤指标、氧化应激指标和凋亡指标的变化,说明补充姜黄素可以通过上调Nrf2、HO-1蛋白表达,提高SOD活性,有效缓解过度训练及其引发的氧化应激状态,上调Bcl-2,下调Bax,有效升高Bcl-2/Bax比值,抑制大鼠心肌细胞凋亡过程的继续发展,发挥对心脏的保护作用。

2.5 各组大鼠心肌T-AOC、SOD活性及MDA浓度变化

长时程、高强度运动时,心肌细胞内还原型辅酶I氧化酶、黄嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶等活性增强,导致线粒体内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成增多,大量的ROS除了引起线粒体本身发生损伤,还会引起整个心肌细胞氧化应激风险增加[34]。本研究结果显示(表4),OM组心肌T-AOC和SOD活性极显著低于C组(p<0.01),MDA浓度极显著高于C组(p<0.01);COM组心肌T-AOC和SOD活性极显著高于OM组(p<0.01),MDA浓度显著低于OM组(p<0.05)。结合Nrf2和HO-1表达变化,表明长时程、高强度运动通过抑制抗氧化酶发挥生物学活性,诱导心肌氧化应激增强。Nrf2转录活性降低,造成其下游抗氧化蛋白HO-1的表达下降,机体抗氧化能力也随之下降,脂质过氧化产物增多。而补充姜黄素通过上调Nrf2表达,增强HO-1表达,提高心肌T-AOC和SOD活性,引起MDA浓度显著降低,改善了心肌抗氧化能力。

表4 各组大鼠心肌T-AOC、SOD活性及MDA浓度Table 4 T-AOC,SOD activity and MDA concentration in myocardium between rats in each

3 结论

本研究中,8周递增负荷游泳训练引发大鼠过度训练,氧化应激加剧并加速心肌细胞凋亡,心肌组织形态发生病理性改变并出现功能异常。训练过程中对大鼠以200 mg/(kg·d)剂量姜黄素进行营养干预,能够通过上调Nrf-2(p<0.01),增加HO-1(p<0.05)表达,提高T-AOC和SOD活性(p<0.01),降低MDA浓度(p<0.05),有效缓解过度训练的发生与发展及其引发的氧化应激状态,从而引起抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加(p<0.01),促凋亡蛋白Bax表达减少(p<0.01),抑制大鼠心肌细胞凋亡(p<0.01),保护心脏组织结构和功能正常。