响应面法优化复合菌种发酵葡萄玫瑰花饮品及其抗氧化能力的测定

王舸楠,刘维兵,王雪薇,全 莉,尹丽萍,武 运,*,薛 洁

(1.新疆农业大学 食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐,830052) 2.中国食品发酵工业研究院,北京 100015)

玫瑰(Rosarugosa)是一种集药用、食用、美化、绿化于一体的木本植物,含有丰富的酚类和萜烯类物质,具有极高的食用价值和药用价值[1]。葡萄(Vitisvinifera)是世界上广泛种植的水果之一,具有多种生物学功能,如抗菌、抗癌、抗氧化就、抗炎的作用,因其含有丰富的多酚和黄酮类化合物而具有天然的抗氧化能力而深受人们喜爱[2]。目前,人们对玫瑰和葡萄发酵主要是制备酒类或浓缩果汁类饮品。近些年随着发酵饮品的兴起,越来越多的食品企业开始使用不同的原材料制备发酵饮品[3]。其在保留原材料营养物质的同时又增加了微生物通过发酵所产生的特有生物活性物[4]。目前发酵饮品种类繁多,由不同原材料和益生菌发酵形成的发酵液具有不同的风味和抗氧化能力。李凡等[5]通过筛选不同的酵母菌,设置不同时间、温度通过发酵白首乌从而得到白首乌酵素的最优SOD活力。刘进杰等[6]通过优化葡萄皮渣发酵工艺从而提高了发酵液的抗氧化活性。目前,发酵饮品正在朝着通过筛选发酵菌种,监控发酵体系,合理的抑制杂菌生长。提高饮品安全性的方向发展。

本文选用可应用于制麦过程中的白地霉[7]与乳酸菌对玫瑰花与葡萄汁进行发酵制备饮品。白地霉(Geotrichumcandidum)最初归属于霉菌,1983年Barnett等在其编写的《Yeasts:Characteristics and Identification》一书中将白地霉列入酵母菌类群中,研究表明白地霉在发酵过程中会产生脂类和β-苯乙醇的香气物质且具有食用安全性[8]。本文首次使用白地霉和乳酸菌对玫瑰与葡萄发酵液进行发酵,以达到产酸和提高感官评分的目的,选取发酵时间、温度与不同菌种的添加量做为单因素,以总多酚含量为响应值通过响应面法优化葡萄玫瑰花发酵工艺,测定发酵饮品的SOD活力、花青素含量、DPPH清除能力以评估发酵饮品的体外抗氧化能力,预制备一款口感优良具有抗氧化能力的饮品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食用玫瑰、品种丰花 湖北枣阳倪氏国际玫瑰研究中心;酿酒葡萄 品种赤霞珠,采自新疆北疆产区;白地霉(GC)、植物乳杆菌(LP) 由实验室提供;总多酚试剂盒、花青素试剂盒 西班牙Biosystem股份公司;总SOD试剂盒 南京建成生物工程研究所。

SHIMADZU UV-1780 紫外分光光度计 日本岛津仪器有限公司;10、50、100 mL容量瓶 天津市天玻玻璃仪器有限公司;超纯水机 美国赛默飞世尔科技公司;LRH-250生化培养箱 上海沪粤明科学仪器有限公司;冷冻离心机 北京雷勃尔医疗器械有限公司;精密天平 瑞士梅特勒-托利多集团;恒温水浴锅 北京科伟有限公司;Y 15葡萄酒自动分析仪 西班牙Biosystem股份公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄玫瑰花发酵饮品制备工艺

1.2.1.1 工艺流程

1.2.1.2 操作要点 葡萄汁以葡萄经压榨过滤后70 ℃保温5 min杀菌,于4 ℃环境下保存[9];玫瑰干花去花托后,将花瓣剥离放入500 mL锥形瓶中,加入葡萄汁后补无菌水至所需刻度接种进行发酵,后扩培,发酵结束后过滤并于7500 r/min条件下离心。

发酵菌种由斜面取一环于10 mL液体培养基(白地霉于YPD培养基,乳酸菌于MRS培养基)中活化,为不影响发酵饮品的感官评分,菌种以10%苹果浓缩汁无菌水溶液作为培养基进行10倍扩培。菌种白地霉于28 ℃条件下培养31 h,乳酸菌在36 ℃条件下培养48 h。

1.2.2 葡萄与玫瑰花的配比 为模拟葡萄玫瑰花发酵液的条件,首先加入1%的玫瑰花以作为初始玫瑰添加量,加入10%、20%、30%、40%、50%的葡萄汁,后补无菌水至300 mL,测定葡萄玫瑰花混合液的总多酚,感官评分确定葡萄汁的添加量;葡萄汁添加量为上面实验中得出的适宜条件,加入0.5%、0.75%、1.00%、1.25%、1.5%的玫瑰花,通过总多酚、感官评定评分确定玫瑰花的添加量。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同复合菌种添加比对发酵液总酸与总多酚含量的影响 在锥形瓶中准确称取2.25 g玫瑰花瓣,加入90 mL葡萄汁,补水至300 mL,在发酵温度为33 ℃,发酵时间为48 h条件下,菌种以扩培液的形式以发酵液总量的百分比加入发酵液中,复合菌种的总接种量为发酵液的10%,考察白地霉、乳酸菌的添加量分别占总添加量的比为7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7的情况下对总多酚、总酸含量的影响。

1.2.3.2 不同发酵温度对发酵液总酸与总多酚含量的影响 在锥形瓶中准确称取2.25 g玫瑰花瓣,加入90 mL葡萄汁,补水至300 mL,在白地霉、乳酸菌添加比为5∶5,发酵时间为48 h下考察发酵温度为23、28、33、38、43 ℃ 情况下对总多酚、总酸含量的影响。

1.2.3.3 不同发酵时间对发酵液总酸与总多酚含量的影响 在锥形瓶中准确称取2.25 g玫瑰花瓣,加入90 mL葡萄汁,补水至300 mL,在白地霉、乳酸菌添加比为5∶5,发酵温度为33 ℃条件下考察发酵时间为12、24、36、48、60 h 情况下对总多酚、总酸含量的影响。

1.2.3.4 不同发酵初始pH对发酵液总酸与总多酚含量的影响 在锥形瓶中准确称取2.25 g玫瑰花瓣,加入90 mL葡萄汁,补水至300 mL,在白地霉、乳酸菌添加比为5∶5,发酵温度为33 ℃条件,发酵时间48 h条件下。通过添加3%碳酸氢钠溶液调整发酵液的初始pH考察初始pH为4、4.5、5、5.5、6的条件下对总多酚、总酸含量的影响,自然条件下发酵液初始pH为3.93。

1.2.4 响应面法优化白地霉发酵工艺 通过单因素实验,选取发酵时间、发酵温度、菌种添加比三个因素,使用 Design Expert 8.0.6 软件,设计3因素3水平Box-Behnken中心组合实验,响应面因素及水平设计如表1所示。

表1 响应面实验因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 葡萄玫瑰花发酵饮品感官评价 结合张水华[10]食品感官品鉴,从色泽、气味、滋味和形态四个方面进行综合评定,感官评定表见表2。由5个相关专业人士进行品鉴。样品随即编码,随机发放,按照感官评定表标准进行评估,结果取平均值。

表2 葡萄玫瑰花发酵饮品感官评分表Table 2 Grape-rose fermentative beverage sensory score

1.2.6 总多酚含量的测定 使用Y 15葡萄酒自动分析仪,总多酚试剂盒法进行测定,其中试剂A为2×20 mL福林酚溶液、试剂B为2×20 mL碳酸钠、试剂S为标准品1×5 mL,波长670 nm,分析模型为双试剂终点法,试剂与标准品可直接上机检测;检测步骤,将发酵液离心后取1 mL加入空白皿中。将空白皿放入托盘,置于Y15全自动葡萄酒分析仪中进行检测[11-12]。

1.2.7 总酸含量的测定 参照国标GB/T 15038-2006,利用酸碱中和原理,用氢氧化钠标准滴定溶液直接滴定样品中的有机酸,以pH为8.2作为电位滴定终点,根据消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积,计算试样的总酸含量[13]。

1.2.8 葡萄玫瑰花发酵饮品体外抗氧化能力测定

1.2.8.1 SOD活力测定 按照SOD试剂盒说明书配制试剂,测试样品需要稀释10倍,测定时吸取1 mL样液,按照试剂盒要求依次加入试剂,于波长550 nm下测定吸光度值。

式中,A0:对照OD值,A1:测定OD值,B:反应体系的稀释倍数,C:样本测试前的稀释倍数。

1.2.8.2 花青素含量的测定 使用Y 15葡萄酒自动分析仪,花青素试剂盒进行发酵饮品中花青素含量的测定,其中,试剂A为卤代缓冲溶液,分析模型为单试剂终点法,波长520 nm,试剂与标准品可直接使用,检测步骤,将发酵液离心后取1 mL加入空白皿中。将空白皿放入托盘,置于Y 15全自动葡萄酒分析仪中进行上机检测[14-15]。

1.2.8.3 DPPH自由基清除能力 使用DPPH法研究葡萄玫瑰花发酵饮品中的抗氧化能力,取0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL Trolox母液分别于10 mL容量瓶中并稀释成不同浓度,取0.1 mL各浓度Trolox溶液加入25 mg/L的3.9 mL DPPH甲醇溶液中,避光反应20 min,在517 nm波长下测定吸光度,以Trolox浓度为Y轴,吸光度为X轴绘制标准曲线。用同样的方法测定样品在517 nm处的吸光度,结果以Trolox的当量值TEAL表示,单位为 μmol/L。每个样品处理重复3次[16],标准曲线方程为y=788.59x+156.66,R2=0.995。

1.3 数据处理

每组实验重复三次,使用Design-expert V8.0.6 进行响应面设计及统计分析,采用Origin 9.0进行数据处理并作图。

2 结果与分析

2.1 玫瑰花与葡萄汁添加量对发酵液中总多酚与感官评分的影响

葡萄汁添加量由图1所示,总多酚含量随着葡萄汁添加量的增多而升高,当添加量为50%时总多酚含量最高,达到9.92×102mg/L。随着葡萄添加量的升高,感官评分同时升高,当葡萄添加量达到30%时分数最高,达到92分。之后开始下降,这是由于随着葡萄添加量升高,葡萄所带来的甜腻程度开始升高,从而影响感官评分。玫瑰花添加量由图2所示,总多酚含量随着玫瑰花添加量的增多而升高,当玫瑰花添加量为1.5%时总多酚含量最高,达到10.92×102mg/L。随着玫瑰花添加量的增多,感官评分先升后降,其中,玫瑰花在添加量为0.75%时所得感官评分最高为91分。之后开始下降,这可能是由于植物总多酚含量的偏高会带来苦涩口感[17],随着玫瑰花添加量的增多,发酵液总多酚含量升高,发酵液苦涩口感增重,从而影响感官评分,最终确定玫瑰花添加量为0.75%,葡萄汁添加量为30%。

图1 不同葡萄汁添加量对总多酚与感官评分的影响

图2 不同玫瑰花添加量对总多酚与感官评分的影响

2.2 单因素实验

2.2.1 不同复合菌种添加比对发酵液总多酚与总酸含量的影响 结果如图3所示,在发酵过程中,随着复合菌种体系中乳酸菌添加量增高,总酸含量开始升高,当复合菌种添加比为3∶7时总酸含量最高,达到3.73 g/L。总多酚含量随着复合菌种体系中乳酸菌添加量的增高而降低。当复合菌种添加比为3∶7时总多酚含量最低,为9.49 mg/L,当添加比为7∶3时总多酚含量最高,达到9.83 mg/L。这可能是因为乳酸菌在发酵过程中总酸含量升高,降低溶液pH,从而在一定程度上影响酶的活性,微生物的细胞膜所带电荷会有所改变,因此改变了细胞膜的透性,从而降低了复合菌种体系对营养物质的吸收和代谢物的排泄[18],考虑到乳酸菌添加量对发酵液酸度的影响,最终选取6∶4、5∶5、4∶6作为响应面的三水平。

图3 复合菌种配比对总多酚与总酸含量的影响

2.2.2 不同发酵时间对发酵液总多酚与总酸含量的影响 结果如图4所示,总酸含量随着发酵时间的增长而升高,在发酵60 h时达到3.53 g/L。总多酚含量同样随着发酵时间的增长而升高,在发酵第60 h时达到9.83×102mg/L,其中,在发酵12～48 h,总多酚含量增长较快,增长了0.67×102mg/L,在发酵48 h后总多酚含量增长缓慢。这可能是由于发酵开始时总多酚从原材料中的溶出率增大,发酵48 h后,其溶出速率开始缓慢下降的原因。根据单因素试验最终选取36、48、60 h作为响应面三水平。

图4 不同发酵时间对总多酚与总酸含量的影响

2.2.3 不同发酵温度对发酵液总多酚与总酸含量的影响 结果如图5所示,总酸主要受到乳酸菌发酵的影响,其中,在发酵温度为38 ℃时,总酸含量最高,而低于38 ℃时,因未达到乳酸菌最适发酵温度,发酵液中总酸含量有所降低。总多酚含量随着发酵温度的升高而升高,在发酵温度为33 ℃最高,达到9.84×102mg/L。这可能是由于在发酵液中,分子的渗透、扩散、溶解速率会随着温度升高而加快。高温可在一定程度上破坏细胞壁的完整性,使活性物质易从果肉细胞转移到溶剂中[19]。根据单因素试验最终选取28、33、38 ℃作为响应面三水平。

图5 不同发酵温度对总多酚与总酸含量的影响

2.2.4 不同初始pH对发酵液总多酚与总酸含量的影响 结果由图6所示,总酸含量随着初始pH升高而升高,初始pH为6时总酸含量最高,达到 3.9 g/L;其中,初始pH为5～6时,总酸的增长率最高。这可是由于该初始pH范围适合该乳酸菌的生长。总多酚含量随着初始pH的升高先升后降,其中,初始pH在4～4.5范围内时，总多酚含量小幅度增长,达到9.76×102mg/L。初始pH在5～6范围内时,发酵液中总多酚含量下降,当pH为6时总多酚含量最低,为9.47×102mg/L。由于发酵液初始pH为4,pH的升高对总多酚升高无明显意义。因此,以发酵液初始pH作为响应面中的固定pH。

图6 不同初始pH对总多酚与总酸的影响

2.3 响应面法优化葡萄玫瑰花发酵饮品工艺

发酵液在发酵过程中,总多酚含量明显增加,且为了凸显发酵饮品的抗氧化能力,选择总多酚作为响应值,以单因素实验为基础,通过Box-Behnken中心组合实验设计原理,设计以复合菌种添加比(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)为基础的3因素3水平共17组响应面分析实验。实验因素和水平见表1,中心组合实验设计及结果见表3,方差分析见表4。响应面分析图见图7。

表3 响应面试验因素及水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design

表4 多元回归方程的方差分析Table 4 Variance analysis of multiple regression equation

通过Design-Expert V 8.0.6软件对分析结果进行多元回归拟合,得到方程为:

Y=9.86-0.24A-0.1B+0.038C-0.13AB-0.063AC-0.072BC-0.12A2-0.33B2-0.26C2

由表4可知,一次项与二次项均对发酵液总多酚含量影响表现出极显著水平,交互项AB、AC、BC对总多酚含量影响表现均为显著(p<0.05)。且根据显著性与F值大小可知,影响总多酚含量因素的主次顺序为：添加比(A)>发酵温度(B)>发酵时间(C)。

多酚类物质包括黄酮化合物与花色苷等物质,因其具有较强的自由基清除能力,也可作为发酵饮品抗氧化能力的重要指标[20]。为了反映各因素及其交互作用对总多酚含量的影响,对回归方程绘制三维响应面图及其等高线,结果如图7所示,菌种添加比和发酵温度的交互作用显著,当复合菌种配比中白地霉添加量增加时,发酵液总多酚含量升高,且发酵温度也与单因素结果相符。菌种添加比与发酵时间交互作用显著,由图可看出随着白地霉添加量增加、发酵时间增长,总多酚含量升高。发酵温度与发酵时间交互作用显著,随着发酵温度和发酵时间的增加,总多酚含量呈极大值点。

图7 各因素交互作用对总多酚含量影响的响应面图和等高线图

经过响应面模型预测,葡萄玫瑰花发酵饮品中总多酚含量最佳工艺是在葡萄汁添加量为30%、玫瑰花添加量为0.75%的条件下,白地霉与乳酸菌的添加比为5.5∶4.5,发酵温度为32.6 ℃,发酵时间为48.2 h,在该最佳工艺条件下,葡萄玫瑰花发酵饮品中的总多酚含量应为9.96×102mg/L,对工艺进行优化后,选取添加比为5.5∶4.5,发酵温度为33 ℃,发酵时间为48 h,进行三次平行实验且取平均值,在此条件下葡萄玫瑰花发酵饮品的总多酚含量测定值为9.92×102mg/L,与预测值的相对误差为0.4%,说明该工艺可行,具备一定的应用价值。

2.4 葡萄玫瑰花发酵饮品动态感官评定

按照响应面优化工艺进行葡萄玫瑰花发酵饮品的发酵实验,总发酵时间为60 h,按照每12 h取样并离心进行感官评定,结果由图8所示,第12 h由于菌种还未起酵,葡萄汁所带来的甜腻口感在很大程度上影响了感官评定评分,随着发酵的进行,发酵液内的酸甜口感逐渐趋于平衡,当发酵时间为48 h时，感官评分最高为92,当发酵时间为60 h时,由于乳酸菌发酵代谢乳酸增多消耗了过多的糖,导致发酵液口感偏酸,影响感官评定评分。

图8 葡萄玫瑰花发酵液动态感官评定评分

2.5 葡萄玫瑰花发酵饮品体外抗氧化能力测定

2.5.1 发酵过程中SOD活力的变化 每12 h对葡萄玫瑰花发酵液取样离心进行测定,结果由图9所示,随着发酵时间的增长,葡萄玫瑰花发酵液的SOD活力升高,其中0～24 h增长速率较快,SOD活力增长了4.78×103U/L,在复合菌种发酵第24 h后,SOD活力趋于稳定,当发酵时间为48 h时SOD活力达到5.31×103U/L。

图9 葡萄玫瑰花发酵过程中SOD活力的变化

2.5.2 发酵过程中花青素含量的变化 实验结果如图10所示,花青素是一类优良的天然抗氧化剂,其抗氧化能力是维生素E的50倍,且比维生素C高20倍[20],葡萄玫瑰花发酵液在发酵过程中,花青素含量基本维持在28 mg/L左右,在发酵后与发酵起始时对比,发酵过程中花青素含量升高了将近2 mg/L,但含量维持于稳定状态,因此复合菌种发酵过程没有影响到花青素含量,使其依然保持了葡萄和玫瑰花富含的天然花青素含量。

图10 葡萄玫瑰花发酵过程中花青素含量的变化

2.5.3 发酵过程中DPPH自由基清除能力 结果如图11所示,发酵过程中DPPH自由基清除能力随着发酵时间的增长而升高,在发酵第48 h时，达到857 μmol/L。在发酵48 h内共增长了357 μmol/L。

图11 葡萄玫瑰花发酵过程中DPPH自由基清除力的变化

3 结论

在葡萄汁添加量为30%、玫瑰花添加量为0.75%的条件下,选取复合菌种白地霉和乳酸菌的添加量为5.5∶4.5,发酵温度33 ℃,发酵时间48 h进行发酵,其总多酚含量为9.92×102mg/L,且在该条件下感官评分为92。之后,对发酵饮品进行体外抗氧化能力测定,结果表明,在复合菌种发酵作用下,SOD活力达到5.31×103U/L,且发酵过程没有影响葡萄与玫瑰花中花青素含量的变化,DPPH自由基清除能力也由500 μmol/L升高至857 μmol/L。

本文首次使用白地霉与乳酸菌复合发酵葡萄与玫瑰花制备发酵饮品。根据实验结果表明,其在保留了原材料抗氧化能力同时,又通过复合菌种发酵增加了酸甜的口感,并同时提高了抗氧化能力,增加了原材料的附加值,有利于葡萄玫瑰花产业发展。