咪唑基离子液体表面活性剂与牛血清蛋白混合体系相互作用研究

王军 李迎宾 杨许召 邹文苑 王萍 惠蒙蒙

关键词：

咪唑基离子液体;表面活性剂;牛血清蛋白;相互作用

摘要：以N-甲基咪唑、溴代十四烷和双氰胺银为原料，采用两步法合成了1-十四烷基-3-甲基咪唑双氰胺盐（[C14mim][DCA]），并对其与牛血清蛋白（BSA）混合体系的相互作用进行研究，结果表明：1）混合体系的cmc值和Amin值均随BSA浓度的增加而变大;2）混合体系中[C14mim][DCA]与BSA间的相互作用对BSA上氨基酸残基微环境有影响，且主要影响BSA上的色氨酸（Trp）残基;3）混合体系中[C14mim][DCA]与BSA间的相互作用会影响体系的水力学半径，且随着[C14mim][DCA]浓度的增加，[C14mim][DCA]/BSA体系的水力学半径变大，并对BSA的结构产生影响——使BSA展开.

0 引言

蛋白质和表面活性剂的相互作用一直是業界近几年来的研究热点.其中，牛血清蛋白与表面活性剂相互作用机理的研究对蛋白质的变性、再折叠、浮选和分离等技术具有指导意义[1-2].同时，蛋白质又是生命的基础物质，是一类带有疏水基的两性聚电解质，存在等电点，因此其与表面活性剂之间的相互作用和表面活性剂的种类有很大关系.阴离子表面活性剂与蛋白质可以产生很强的相互作用，导致蛋白质变性，且已经被广泛研究[3-5].对于阳离子表面活性剂与蛋白质相互作用的研究也有相关报道[6-7]，但相比于阴离子表面活性剂与蛋白质的研究而言稍显缺乏.

离子液体表面活性剂作为一种功能化离子液体，是近年来发展起来的新型表面活性剂，一般由疏水侧链和亲水头基两部分组成，具有亲水、亲油两亲特性，且其极性、亲水性、亲油性可以通过选择合适的阴离子、阳离子来进行调整[8-9]，兼有离子液体和表面活性剂的性质，具有更广的应用前景，特别是在生物和医药领域.T.Singh等[10]研究了不同链长与明胶的相互作用，于丽等[11-12]以表面张力和荧光光谱法研究了咪唑类离子液体与牛血清蛋白的相互作用行为.然而，对于离子液体与牛血清蛋白（BSA）相互作用机理的研究之信息有限.本文拟以N-甲基咪唑、溴代十四烷和双氰胺银为原料，采用两步法合成一种咪唑基离子液体表面活性剂——1-十四烷基-3-甲基咪唑双氰胺盐（[C14mim][DCA]），并研究其与牛血清蛋白混合体系的相互作用，探讨其相互作用机理，以期为此类表面活性剂在生物和医药领域的推广应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

主要试剂：N-甲基咪唑、溴代十四烷（工业级），江苏盐城市龙升精细化工厂产;双氰胺银（质量分数为99%），郑州轻工业大学实验室制;硫氰酸钾（质量分数为98.5%），天津风船化学试剂有限公司产;甲醇（AR），天津永大化学试剂有限公司产;乙腈（AR），科密欧化学试剂有限公司产;丙酮（AR），洛阳化学试剂厂产;乙酸乙酯（AR），天津富宇精细化工有限公司产;牛血清蛋白（BSA，分子量68 000），Solarbio公司产.

主要仪器：SZCL-2型智能磁力搅拌电热套，上海司乐仪器有限公司产;RE-2000A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;10-ND型真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司;Avance300型核磁共振仪，德国Bruker公司产;K100 自动界面张力仪，德国Kruss公司产;ALV-3动静态同步激光光散射仪，德国ALV公司产;Hitachi U-3900H型紫外可见光谱仪、Hitachi 7000型荧光分光光度计，日立高新技术公司产.

1.2 离子液体表面活性剂的制备

1.2.1 [C14mim][Br]的制备 分别称取16.42 g （0.2 mol）N-甲基咪唑和55.46 g（0.2 mol）溴代十四烷，将其放入250 mL的三口烧瓶中，加入50 mL异丙醇，升温至80 ℃，搅拌反应48 h，冷却后用旋转蒸发仪蒸出溶剂，用乙酸乙酯洗涤3次，冷冻结晶得白色晶体，即为产物[C14mim][Br]，收率88.7%.

1.2.2 目标产物的制备 称取35.39 g （0.1 mol）的[C14mim][Br]放入 250 mL 单口烧瓶中，加入去离子水搅拌使其充分溶解，再缓慢滴加用去离子水混合均匀的20.87 g （0.12 mol）的AgN（CN）2，快速搅拌，40 ℃下避光反应6 h，静置，取上层清液减圧蒸馏除去溶剂后加入过量甲醇充分搅拌溶解，0 ℃ 下静置2 h后，过滤除去不溶物，重复操作直至无沉淀析出，减压蒸馏出甲醇，继续依次用乙腈、丙酮反复洗涤.洗涤至无不溶物后减压蒸馏除去溶剂，冷冻真空干燥48 h，即得目标产物，收率89.7%.

1.3 表征与测定方法

1.3.1 目标产物的结构表征 采用核磁共振波谱仪对目标产物的结构进行测定，溶剂为氘代二甲基亚砜.

1.3.2 混合体系表面活性参数的测定 采用表面张力法，向已配制好的溶度分别为2×10-6 mol/L，1×10-5 mol/L和 5×10-5 mol/L的BSA溶液中滴加离子液体表面活性剂，在自动表面张力仪上测定混合体系的表面活性参数，

1.3.5 混合体系水力学半径分布测量 固定BSA浓度为5×10-5 mol/L，配制含有不同离子液体表面活性剂浓度的混合体系溶液.采用动静态同步激光光散射仪对混合体系进行水力学半径分布测量，每次测量前将所有样品经 0.45 μm的滤膜过滤，以除去灰尘.

以上实验温度均为（25±1） ℃.

2 结果与讨论

2.1 目标产物结构表征结果

目标产物的1H NMR和13C NMR表征结果如下：

2.2 [C14mim][DCA]/BSA体系的表面活性分析  [C14mim][DCA]/BSA体系的表面活性参数见表1.由表1可知，当BSA浓度为0 mol/L时，[C14mim][DCA]具有很好的表面活性.随着BSA浓度的增加，临界胶束浓度（cmc）值逐渐增大，这是因为在[C14mim][DCA]中加入BSA后，随着浓度的逐渐增大（小于1.0×10-5 mol/L），由于静电吸引，大部分的[C14mim][DCA]与BSA发生相互作用，体系中游离的[C14mim][DCA]减少;当[C14mim][DCA]浓度大于1.0×10-5 mol/L时，离子液体表面活性剂在BSA上的静电吸附达到饱和，体系表面张力急剧下降，cmc值增大.[C14mim][DCA]与BSA相互作用使BSA的结构发生了变化，BSA链的展开使[C14mim][DCA]的Гmax减小，Amin增大.

2.3 [C14mim][DCA]/BSA体系的紫外可见光谱分析  [C14mim][DCA]/BSA体系的紫外可见光谱如图1所示.由图1可知，BSA溶液在紫外区278 nm左右处有明显的吸收峰，根据文献[13]可知，芳香性氨基酸上的芳杂环n-π*跃迁可以在250 ～300 nm范围内产生紫外吸收，其吸收性质由芳香族氨基酸的含量所决定.[C14mim][DCA]在此紫外区间内没有吸收峰，但当BSA中加入[C14mim][DCA] 后，BSA的吸收峰强度发生了变化，这说明[C14mim][DCA]与BSA发生了相互作用，对BSA上氨基酸残基的微环境产生了影响.随着[C14mim][DCA]浓度的增大，体系的吸收峰强度逐渐增大，而在278 nm处的峰位置并未发生明显的红移或蓝移，说明[C14mim][DCA]对BSA蛋白质肽链上的芳香性氨基酸残基的周围微环境影响较小.

2.4 [C14mim][DCA]/BSA体系的荧光光谱分析2.4.1 稳态荧光光谱分析 [C14mim][DCA]/BSA体系的稳态荧光光谱图如图2所示.由图2可以看出，BSA在338 nm左右有强吸收峰，而[C14mim][DCA]在300～450 nm范围内没有明显吸收峰.随着[C14mim][DCA]浓度的增大，体系的吸收峰强度逐渐降低，同时伴随着蓝移， 最大发射波长从338 nm减小到332 nm.这种转变表明，[C14mim][DCA]/BSA复合物的形成，导致BSA的氨基酸残基暴露在

更加疏水的微环境中[14];当[C14mim][DCA]浓度大于3.0×10-3 mol/L时，体系的最大发射峰变化较小.因此，较低浓度（<3.0×10-3 mol/L）的[C14mim][DCA]對BSA的二级结构有稳定作用，而高于一定浓度（>3.0×10-3 mol/L）时有破坏作用，二级结构的破坏使BSA展开并变性，故[C14mim][DCA]在保护和破坏BSA结构上具有更大的优势.

2.5 [C14mim][DCA]/BSA体系的水力学半径分布与分析  [C14mim][DCA]/BSA体系的水力学半径（Rh）分布结果如图4所示.由图4可以看出，体系的水力学半径在4.6 nm和100 nm左右有两个峰.当[C14mim][DCA]浓度小于2.0×10-4 mol/L时，体系的水力学半径没有明显变化，但当其浓度为5.0×10-4 mol/L时，原来两个峰的强度减弱，在648 nm处出现一个新峰，这是由于[C14mim][DCA]的加入导致部分BSA的结构发生变化，使BSA链展开，随着其浓度的增大，648 nm的峰向更大半径分布方向移动;当其浓度为1.2×10-3 mol/L时，半径分布为898 nm左右，并且相关强度也随之增大;当浓度为5.0×10-3 mol/L时，半径分布为1150 nm左右，再增大浓度，半径分布变化较小，推测此时BSA已经完全展开，除4.6 nm处和1150 nm处之外，在1～10 nm 之间还有一个半径分布，这可能是由[C14mim][DCA]与BSA的复合物达到饱和后在水溶液中形成的自由胶束产生的.

3 结论

本文以N-甲基咪唑、溴代十四烷和双氰胺银为原料，采用两步法合成了咪唑基离子液体表面活性剂，经核磁共振确认该产物为[C14mim][DCA]，运用表面张力法、紫外可见光谱法、荧光光谱法和动态光散射法研究了[C14mim][DCA]与BSA在其混合体系中的相互作用，得到如下结论：

1） 混合体系的cmc值和Amin值均随BSA浓度的增加而变大;

2） 混合体系中[C14mim][DCA]与BSA间的相互作用对BSA上氨基酸残基微环境有影响;混合体系中[C14mim][DCA]浓度较低时，对BSA的二级结构有稳定作用，而高于一定浓度时有破坏作用，二级结构的破坏使BSA展开并变性，且主要影响BSA上的Trp残基;

3） 混合体系中[C14mim][DCA]与BSA的相互作用会影响体系的Rh，且随着[C14mim][DCA]浓度的增加，[C14mim] [DCA]/BSA体系的Rh变大，当其浓度为5.0×10-3 mol/L时， BSA已经完全展开.

该研究将为理解离子液体表面活性剂与蛋白质的相互作用，并为拓展离子液体表面活性剂在蛋白质领域的应用提供重要的理论依据.

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