5种提取方法对甲鱼油品质的影响

宋恭帅 张蒙娜 俞喜娜 陈 康 李诗言 王 扬戴志远 沈 清

(1浙江工商大学海洋食品研究院,浙江 杭州 310012；2浙江省水产质量检测中心,浙江 杭州 310023；3浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室,浙江 杭州 310012)

中华鳖(Trionyx sinensis),俗称甲鱼,是一种珍贵的水产经济动物[1],富含蛋白质、维生素及人体所需的必需微量元素等,对心脑血管疾病有很好的防控作用[2]。 近年来,随着甲鱼养殖规模及消费市场的日益壮大,如何合理地处理甲鱼宰杀加工过程中所产生的大量废弃物是一大难题,若处理不当,不仅会造成资源浪费,且易污染环境。 现今,有不少研究者提出,从甲鱼加工废弃物中提取甲鱼油是一条将加工废弃物变废为宝的极好途径[3-5]。 陶轶松等[3]利用酶解法从甲鱼加工废弃的四肢脂肪中提取甲鱼油,提取率高达76.3%。 甲鱼油中含有铁、锌、硒、铜等微量元素和丰富的花生四烯酸、亚麻酸、油酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)等n-3 系多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)。 研究表明,EPA、DHA 等具有健脑明目、降血压、降血脂、增加血液循环及抗炎等生理功效,在临床上已被用于治疗和预防动脉硬化等相关疾病[6-7]。

目前,水产品加工废弃物中油脂的提取方法有蒸煮法[8]、酶解法[9]、稀碱水解法[10]、溶剂法[11]和超声辅助溶剂法[12]等。 提取方法作用机理的不同易造成油脂品质的差异,但尚缺乏对大多已报道的关于水产品中油脂提取方法对其品质的作用效果的系统分析。因此,本研究以甲鱼脂肪为原料,采用酶解法、淡碱水解法、溶剂法、超声辅助溶剂法和蒸煮法5 种提取方法提取甲鱼油,并以甲鱼油的感官特性、理化性质、脂肪酸组成及挥发性成分作为评价指标,研究不同提取方法对甲鱼油品质的影响,以期为甲鱼加工废弃物的合理利用及优化甲鱼油提取方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲鱼脂肪(取自甲鱼内脏),由浙江省水产质量检测中心提供；37 种脂肪酸甲酯混标(纯度为99.9%),美国Sigma 公司；超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm),由Milli-Q 纯水系统制得；正己烷、异丙醇、无水硫酸钠等均为分析纯,购自西陇化工股份有限公司。

1.2 主要仪器与设备

50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS) 涂层萃取头,美国Supelco 公司；7890A 气相色谱仪,美国Agilent 公司；Trace GC Ultra 气相色谱与DSQ Ⅱ质谱联用仪,美国Thermo Fisher Scientific 公司；Ultra-Turrax T18 basic 均质机,德国IKA 公司；ROTINA 420R 离心机,德国Hettich 科学仪器公司；LRH-150-S 恒温恒湿培养箱,广东省医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 取甲鱼脂肪置于均质机中,8 000 r·min-1破碎5 min,用于提取试验。

1.3.2 甲鱼油提取方法

1.3.2.1 酶解法试验 参照Routray 等[9]的方法。取10 g 甲鱼脂肪,加入1.25 g 中性蛋白酶和15 mL水,置于水浴锅中60℃恒温酶解2.5 h。 待反应结束后,于4 500 r·min-1、4℃条件下离心20 min,得到上清液为甲鱼油。

1.3.2.2 淡碱水解法试验 参照张伟伟等[10]的方法。 称取10 g 甲鱼脂肪于具塞锥形瓶中,加入15 mL蒸馏水,并缓慢滴加20% KOH 调节溶液pH 值至7。在65℃条件下水解35 min 后,加入0.4 g 氯化钾盐析10 min。 待反应结束后,于5 000 r·min-1、4 ℃条件下离心10 min,得到上清液为甲鱼油。

1.3.2.3 有机溶剂法试验 参照Xie 等[11]的方法。称取10 g 甲鱼脂肪,以正己烷-异丙醇(3 ∶2,v/v)为提取溶剂,料液比1 ∶10 g·mL-1,于60℃条件下浸提30 min。 待浸提结束后,于5 000 r·min-1、4℃条件下离心10 min,并将上清液于65℃旋转蒸发5 min,以除去有机溶剂,得到甲鱼油。

1.3.2.4 超声辅助有机溶剂法试验 参照高娟等[12]的方法。 称取10 g 甲鱼脂肪,以正己烷-异丙醇(3 ∶2,v/v)为提取溶剂,料液比1 ∶10 g·mL-1,于60℃、超声频率53 Hz、超声功率350 W 条件下浸提30 min。 待浸提结束后,于5 000 r·min-1、4℃条件下离心10 min,并将上清液于65℃旋转蒸发5 min,以除去有机溶剂,得到甲鱼油。

1.3.2.5 蒸煮法试验 参照汤小会[8]的方法。 称取10 g 甲鱼脂肪,与等量水混合后置于95℃恒温水浴锅中蒸煮40 min,于5 000 r·min-1、4℃条件下离心10 min,得到上清液为甲鱼油。

1.3.3 甲鱼油提取率的计算

1.3.4 甲鱼油感官评定分析 由20 名(10 名女性、10 名男性)经过专业培训的评估人员对甲鱼油的色泽及气味进行评价,感官评分系统如表1所示。 此外,根据样品特性,确定5 种感官指标,包括鱼腥味、油脂味、油炸味、酸败味及坚果味,评定人员根据气味强弱进行打分评定[13-14]。

表1 甲鱼油感官评分系统Table1 The scoring system for the sensory evaluation of turtle oil

1.3.5 理化指标测定 样品中酸价的测定参照GB 5009.229 - 2016[15]；过氧化值的测定参照 GB 5009.227-2016[16]；碘值的测定参照GB/T 5532-2008[17]；皂化值的测定参照GB/T 5534-2008[18]。

1.3.6 脂肪酸含量测定

1.3.6.1 甲酯化处理 称取0.1 g 样品和2 mL 0.5 mol·L-1NaOH-MeOH 溶液于具塞试管中,振荡摇匀后放入65℃水浴锅中加热30 min,取出并自然冷却至室温,再加入2 mL 15% BF3-MeOH 溶液,振荡摇匀后置于65℃水浴锅中加热3 min,取出并自然冷却至室温,加入2 mL 正己烷萃取,静置分层后取上层清液,并加入约占1/10 体积的无水Na2SO4脱水,将处理好的上层清液用气相色谱(gas chromatography,GC)分析[19]。

1.3.6.2 GC 检测条件 进样模式：不分流；进样量：1 μL；色谱柱：HP-88 氰丙基色谱柱(30 m×0.25 mm,0.20 μm)；载气：高纯氮气；进样口温度：250℃；升温程序：初始温度70℃,保持3 min 后以15℃·min-1升至100℃,保持5 min,再以4℃·min-1升至220℃,保持15 min。

1.3.7 GC-质谱(mass spectrum，MS)分析条件 固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)处理：取3 g 样品放入顶空进样瓶中,用硅胶垫片与铝圈密封,于60℃加热10 min 后将老化后的50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)涂层萃取头插入进样瓶,于60℃吸附30 min 后取出萃取头,并立即将其插入GC 进样口中,250℃解吸3 min 后取出,用于GC-MS 分析测定。

GC 条件：TR-35 MS (30 m × 0.25 mm,0.25 μm)；载气：高纯氦气；进样模式：不分流；进样口温度：250℃；升温程序：柱初温40℃,保持3 min,以5℃·min-1升至90℃,而后以10℃·min-1升至230℃,保持7 min。

MS 条件：传输线温度250℃；检测器温度280℃；离子源(EI)温度200℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 30～500 amu。

采用峰面积归一化法计算样品中各挥发性成分的相对百分含量[20]。 将所得数据置于NIST 2.0 谱库中进行自动检索分析,且仅当正反匹配度(SI/RSI)均大于800 (最大值为1 000)的鉴定结果才予以保留。

1.3.8 数据处理 试验数据统计值以平均值±标准差(x±SD)形式表示,采用SPSS v21.0 进行数据分析,并用Origin 7.5 及Microsoft Excel 2010 进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 甲鱼油感官评定

甲鱼油感官特性主要体现在色泽与气味两方面,感官特性不仅可表征鱼油本身的氧化程度,且能粗略反映品质好坏[21]。 根据专业人员的评定结果(表2),5 种提取方法得到的甲鱼油的色泽均呈现出黄色或淡黄色,其中,淡碱水解法提取的甲鱼油色泽最为澄清透亮且光泽度高,感官评分值最高；而蒸煮法制得的甲鱼油的感官评分值仅为1,表明其感官品质最差,浑浊且无光泽；其他3 种提取方法制得的甲鱼油色泽差异不明显。

表2 甲鱼油色泽评价Table2 The color evaluation for turtle oil

根据不同提取方法制得的甲鱼油感官评分结果,其特征气味差异雷达图如图1所示。 结果表明,5 种甲鱼油的气味有较明显差异。 蒸煮法提取的甲鱼油具有很强的鱼腥味和酸败味,这可能与PUFA 受热易氧化分解有关[14]；而酶解法制备的甲鱼油同样具有强烈的鱼腥味,但酸败味较淡,主要原因是氨基酸等降解产生了1-戊烯-3-醇等小分子醇醛类物质[22]。 有机溶剂法及超声辅助法的作用效果差异不大,2 种甲鱼油的特征气味强弱组成类似。 淡碱水解法提取的甲鱼油鱼腥味最淡,碱液作为甲鱼油精制过程中的脱酸剂,可将油中的游离脂肪酸去除[23]。

2.2 甲鱼油理化特性分析

由表3可知,5 种提取方法得到的甲鱼油提取率存在显著差异(P＜0.05),甲鱼油提取率从高到低的提取方法依次为超声辅助法、有机溶剂法、酶解法、淡碱水解法和蒸煮法。 一般地,酸价(acid value,AV)和过氧化值(peroxide value,POV)主要反映油脂的氧化程度,通常作为判断品质好坏的指标[24-25]。 由于淡碱水解法和蒸煮法的反应温度较高,易导致甲鱼油中部分不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFA)氧化分解,故这2 种方法提取的甲鱼油中AV 值和POV 值较高。而酶解法因其反应时间较长,使提取的甲鱼油的AV与POV 均高于其他2 种甲鱼油。 碘值(iodine value,Ⅳ)主要用于表征油脂中脂肪酸的不饱和度,其数值大小与UFA 所占比例有关[24]。 蒸煮法提取的甲鱼油Ⅳ最低,仅为152.83 g·100g-1,而另外4 种甲鱼油Ⅳ均高于163.36 g·100g-1,预测蒸煮法提取的甲鱼油中UFA 含量可能最低。 皂化值(saponification value,SV)的大小可反映油脂中所含甘油酯的含量[26],5 种提取方法得到的甲鱼油SV 无显著差异(P＞0.05)。 此外,根据鱼油行业标准SC/T 3502-2016[27]可知,由5 种提取方法制备的粗甲鱼油的酸价、过氧化值、碘值及皂化值均达到一级粗甲鱼油标准。

2.3 甲鱼油中脂肪酸组成分析

不同提取方法制备的甲鱼油中饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)、单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)和PUFA 相对百分含量的变化见表4。 结果表明,不同方法提取的甲鱼油中共检出约16 种脂肪酸,主要为C12 ～C22,且各方法提取的甲鱼油中各脂肪酸相对含量差异不大。 为了更直观了解各脂肪酸组分的大致出峰时间,截选了具有代表性的粗甲鱼油样品的气相色谱图(图2)。 图中脂肪酸种类1 ～14 依次为C12：0、 C14：0、C14：1、C16：0、C16：1、C17：1、C18：0、C18：1cis、C18：2cis、C18：3 n3、C20：1、C20：3 n3、C20：5、C22：6。

棕榈酸(C16：0)是鱼油中含量最高的SFA,5 种甲鱼油中C16：0 含量均在18.88%～19.08%,仅酶解法与淡碱水解法存在显著性差异(P＜0.05),这与已报道的酶解法提取的甲鱼油中脂肪酸组成的研究结果相一致[22]。 油酸(C18：1cis)是一种具有良好生理活性的MUFA。 研究报道,长期食用富含油酸的食物能有效降低Ⅱ型糖尿病患病风险[28]。 在提取的甲鱼油中油酸的含量最为丰富,高于38.96%,表明甲鱼油具有较高的营养价值。

油脂中反式脂肪酸(trans fatty acids,TFA)易对人体健康造成危害,过多摄入TFA 会对人体血管内皮细胞造成损伤,且易引起人体系统炎症[29]。 世界卫生组织(world health organization,WHO)要求TFA 摄入量不得超过总能量摄入量的1%,故在生产加工过程中应尽可能避免TFA 生成。 蒸煮法提取的甲鱼油中检测到0.02%TFA(C18：2trans),这是由于蒸煮温度与时间引起天然顺式多不饱和脂肪酸(如α-亚麻酸)中双键的几何异构体化而形成了稳定的反式结构[30]。

表3 甲鱼油理化特性Table3 Physicochemical characterization of turtle oil

图2 具有代表性的甲鱼油样品气相色谱图Fig.2 The representative gas chromatographic profile of FAMEs in the turtle oil

甲鱼油中∑EPA+DHA 在10.51%～10.96%之间,仅次于油酸含量。 研究表明,EPA 是白细胞三烯、血栓烷素和前列腺素类等活性物质合成所需要的前体物质,而DHA 是视网膜细胞膜与大脑皮层中最重要的一类不饱和脂肪酸,经常补充富含EPA 和DHA 的膳食能有效减轻过敏症状[21]。 因此,EPA、DHA 含量的高低可作为评价鱼油品质好坏的标准[31]。 由表4可知,提取的甲鱼油中∑EPA+DHA 含量从高到低的方法分别为有机溶剂法(10.96%)、酶解法(10.88%)、超声辅助法(10.86%)、淡碱水解法(10.66%)及蒸煮法(10.51%)。 故有机溶剂法、酶解法和超声辅助法提取的甲鱼油品质较好。

2.4 甲鱼油挥发性成分分析

不同提取方法制备的粗制甲鱼油中含有较多磷脂、蛋白质、色素及其他杂质,稳定性差,易水解、酸败、氧化,从而生成具有挥发性风味的低分子化合物[32]。本研究利用顶空固相微萃取和气质联用技术(GCMS)对5 种方法提取的甲鱼油中挥发性物质进行分析。 由表5可知,甲鱼油中共鉴定出54 种挥发性物质,其中,醇类10 种、醛类12 种、酮类11 种、烃类16种及其他类5 种。

在油脂中,醛类化合物是不良风味的重要组成成分,主要来自不饱和脂肪酸的氧化降解,可表征油脂的氧化程度。 醛类的感觉阈值一般很低,对整体风味贡献大[33]。 蒸煮法制备的甲鱼油中醛类含量最高(11.91%),有9 种脂肪醛[己醛、(E)-2-戊烯醛、(E)-2-己烯醛、壬醛、庚醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、辛醛、癸醛、1-十二碳烯-3-醛]和1 种芳香醛(对甲基苯甲醛)。 该甲鱼油中己醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛含量最高,且感官阈值低,分别为4.5 μg·kg-1和1 μg·kg-1。 此外,己醛和壬醛具有鱼腥味,含量越高,气味越强烈,这与前期研究确定的金枪鱼油中特征风味物质相一致[34]。 淡碱水解法提取的甲鱼油中醛类含量仅次于蒸煮法,约为6.27%。其他3 种方法提取的甲鱼油中醛类含量相差不大,均在4.38%～4.95%之间。

表4 不同提取方法制备的甲鱼油样品中脂肪酸组成Table4 Fatty acids composition of turtle oil extracted with different methods /%

醇类化合物是由脂肪酸二级氢过氧化物的降解或羰基化合物还原生成,可分为饱和醇类与不饱和醇类。相比之下,不饱和醇类的感觉阈值更低,对整体风味贡献更大[35]。 1-戊烯-3-醇是鱼油中重要的不饱和醇类化合物,可作为评价鱼油氧化程度的参考化合物,且具有鱼腥味等特征风味[36]。 在5 种不同甲鱼油的醇类化合物中,1-戊烯-3-醇含量最为丰富,为0.98%～1.76%,其中,酶解法提取的甲鱼油中最少。

酮类化合物的产生机制与醛、醇类化合物类似,主要通过油脂中氢过氧化物热氧化降解产生[12]。 甲鱼油中酮类化合物较其他类多,但其感觉阈值较低,对鱼油整体风味的影响仍较大。 在检测到的化合物中,2-壬酮、2-十一酮、2-癸酮、2-辛酮和2-庚酮具有更低的感觉阈值,分别为5.5、7、35、50.3 及140 μg·kg-1,对甲鱼油整体风味的贡献更大。 此外,这些酮类化合物具有鱼腥味、油脂味、花香味等。 超声辅助法提取的甲鱼油中酮类含量最少,仅为1.87%。

烃类化合物是甲鱼油中含量最高的挥发性物质,主要由烷基自由基的自氧化作用产生。 由酶解法、淡碱水解法、有机溶剂法、超声辅助法及蒸煮法提取制备的甲鱼油中烃类的含量分别为70.80%、60.27%、60.21%、62.57%、75.33%。 各种烃类(C8 ～C20)的感觉阈值通常较高,对鱼油整体风味几乎没有作用。 此外,部分挥发性小分子烃类为含氧杂环化合物,如2,5-二甲基呋喃、环氧柏木烷可能对整体风味有辅助作用。 2,5-二甲基呋喃具有温和的香味,而环氧柏木烷具有甘甜木香[37]。

表5 不同提取方法制备甲鱼油样品中挥发性成分变化Table5 Volatile flavor profiles of turtle oil extracted with different methods/% /%

表5 (续)

3 讨论

目前常采用酶解法、淡碱水解法、有机溶剂法、超声辅助有机溶剂法及蒸煮法等对动物油脂进行提取。蒸煮法是利用油脂与水互不相容的原理,在加热蒸煮过程中,使动物脂肪细胞破裂,使油脂流出,并以水作为溶剂,从而达到分离油脂的目的[6],该方法操作简单,对设备要求低,但油脂的提取率和品质不高,其主要原因是蒸煮法属物理方法,在蒸煮过程中易产生大量杂质,如胶质、色素等,降低出油率。 此外,长时间高温加热会导致油脂中部分PUFA 链裂解而降低其营养价值,产生游离脂肪酸等。 酶解法的作用原理是通过蛋白酶酶解蛋白质以破坏其与油脂的结合,从而得到油脂[9,38],因其操作条件温和、酶解液可被进一步利用等优点被称为提取动物油脂的理想方法。 酶解工艺条件会影响所提取油脂的品质,且不同部位提取的油脂品质有差异[3]。 本研究采用酶解法从甲鱼内脏中提取甲鱼油,而陶轶松等[3]以甲鱼四肢根部中的脂肪为原料,运用与本研究不同的酶解条件提取甲鱼油。 相比之下,本研究所制得甲鱼油的酸价、过氧化值较低,品质较好。 淡碱水解法则是利用稀浓度的碱液阻止蛋白质和油脂的结合,从而达到提取油脂的目的。 张伟伟等[10]采用改进的钾盐提取法提取斑点叉尾鮰内脏油,发现该方法能有效提高油脂提取率及品质。 本研究中,与其他4 种提取方法相比,淡碱水解法的作用效果一般。 有机溶剂法是基于相似相溶原理,利用三氯甲烷、正己烷、异丙醇等有机溶剂与细胞膜中极性脂结合,破坏蛋白质分子与脂质间的静电和氢键作用,从而提取油脂[39]。 三氯甲烷虽具有良好的油脂溶解性,但毒性较强,故本研究采用毒性较弱的正己烷、异丙醇作为提取溶剂。 结果表明,有机溶剂法得到的甲鱼油提取率为75.34%,与崔益玮等[40]研究报道的以三氯甲烷-甲醇为溶剂制得油脂提取率(76.25%)基本一致。而超声辅助溶剂法是在溶剂法的基础上加以超声波辅助。 超声波是一种机械波,当穿过介质时,会产生并传递强大的能量,使物质表面及缝隙中的有效成分迅速溶出[12]。 本研究结果表明,超声辅助溶剂法能有效提高油脂提取率。

现已报道的有关甲鱼油提取的方法还有超临界CO2萃取法,赵淑静等[41]利用该方法提取甲鱼油,提取率高达96.42%,产品品质好且整个过程未使用有机溶剂,安全性高,但对仪器设备和CO2纯度均有较高要求。 本研究中5 种提取方法的试验参数主要引用于相关文献,并未进行参数优化试验,可能造成试验结果有较明显差异。 今后应进行系统的工艺参数优化,并结合新的仪器设备,进一步完善甲鱼油提取工艺。

4 结论

本研究结果表明,5 种提取方法由于其作用机制不同造成了甲鱼油品质的差异。 其中,超声辅助法的提取率最高,达78.51%,所提取甲鱼油为黄色,较澄清透亮,略有光泽,其酸价、过氧化值、皂化值等理化指标均优于其他甲鱼油,并含有丰富的EPA 和DHA,具有较高的生理活性功效,且挥发性成分中呈现较浓腥臭味的醛类化合物最少,仅为4.38%；酶解法、有机溶剂法、碱液蒸煮法的作用效果仅次于超声辅助法；而蒸煮法的作用效果最差,提取率仅有55.91%,所提油浑浊、无光泽,酸价、过氧化值过高,EPA 和DHA 含量最低,且含有较多的己醛、壬醛、1-戊烯-3-醇等具有鱼腥味、油脂味等特征气味的小分子化合物。 在后续研究中应考虑将超声辅助溶剂法与酶解法相结合,以提高提取率及甲鱼油品质,并尽可能解决有机溶剂的残留问题,以期为甲鱼加工废弃物的合理利用及优化甲鱼油提取方法提供理论依据。