高效液相色谱法测定复方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸降解产物

谢纪珍，崔师睿，周 冲*，尹宁宁，姜晓飞

（1.山东省食品药品审评认证中心，山东 济南 250014；2.山东农业工程学院，山东 济南 250100）

复方氨基酸（15）腹膜透析液是一种用氨基酸替代葡萄糖作为渗透剂，用于营养不良的腹膜透析患者的新型透析治疗产品。其处方组成复杂，含有包括色氨酸在内的15种氨基酸等，目前测定氨基酸含量的方法很多，包括高效液相色谱法（HPLC）、氨基酸分析仪、衍生化法等[1-2]，但测定各种氨基酸降解产物的方法较少，本文选择稳定性较差的色氨酸为例[3]，对其检测方法进行研究。在日常审评过程中发现，不同检测方法检出的色氨酸中降解产物和杂质个数均不同，通过对比美国药典、欧洲药典、英国药典等收载的各种氨基酸原料的检测方法，色氨酸是唯一一个采用HPLC测定降解杂质的氨基酸，其中欧洲药典对色氨酸杂质的检测相对完整，其收录的色氨酸原料的杂质从合成过程中引入的杂质和降解杂质共有12个，并对其中的杂质A采用HPLC法检测[5-8]。通过研究发现，该方法在评价色氨酸原料的稳定性方面基本可行，但复方氨基酸（15）腹膜透析液含有十几种氨基酸组分，这些组分会干扰色氨酸杂质的测定，上述药典中的检测方法专属性较差，不能有效地评价色氨酸的稳定性，为此本研究对检测方法进行了优化和验证。

在参考文献的基础上[4,9-10]，本研究进一步优化色谱条件，建立了一种专属性更强的方法检测制剂中色氨酸的降解杂质，测定并比较了自制复方氨基酸（15）腹膜透析液与上市品中的色氨酸降解杂质，为与本品类似的制剂产品开发提供了一种有效的质量控制和评价手段。

1 材料与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，自动进样器，Aglient Chemstation色谱工作站；XS205型电子天平（梅特勒-托利多）；PHS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂）。色氨酸（中国食品药品检定研究院，批号140624-201506）；色氨酸杂质B（加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司，批号1385-088A2）；色氨酸杂质C（犬尿氨酸，美国Sigma-Aldrich公司，批号BCBN9808V）；色氨酸杂质E（N-甲酰犬尿氨酸，杂质批号1406-083A3），色氨酸杂质G（2-羟基色氨酸，批号1406-094A3，加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司）。复方氨基酸（15）腹膜透析液（青岛力腾化工医药研究有限公司，批号C17031701，C17031702，C17031703）；另选某公司已上市复方氨基酸（15）腹膜透析液做对比研究，批号：S15G03096。

2 方法

2.1 杂质对照溶液配制

精密称取杂质B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羟基色氨酸适量，加水制成浓度分别为99.6，107.8，119.2，97.2 μg/ml的对照溶液。2～8 ℃密封保存备用。

2.2 空白对照溶液配制

按照复方氨基酸（15）腹膜透析液处方，称取除色氨酸以外的其他组分，加水，制成空白对照溶液。

2.3 对照混合溶液配制

精密称取杂质B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羟色氨酸适量，用纯化水溶解，制成各组分浓度约为0.50 μg/ml对照溶液，量取1 ml，加入100 ml复方氨基酸（15）腹膜透析液样品中。

2.4 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以纯水为流动相A，以0.02 mol/L磷酸二氢钾（磷酸调pH 2.7）-乙腈-异丙醇（650:175:175）为流动相B，柱温50 ℃，按表1进行梯度洗脱；检测波长为250 nm。

表1 流动相洗脱梯度

2.5 测定法

取上述杂质对照溶液、空白对照溶液、对照混合溶液以及自制和上市的复方氨基酸（15）腹膜透析液各50 μl，注入色谱仪，记录色谱图至保留时间70 min。各杂质按外标法计算不得大于0.2 %，最大其他杂质不得大于0.2 %，总杂质不得过1.0 %。

3 方法对比与方法学验证

3.1 色谱条件比较

氧化破坏样品制备 称取色氨酸对照品适量，加纯化水溶解，取5 ml加30 %双氧水5 ml，置入10 ml量瓶，于60 ℃下放置5 h，取出待用。取氧化破坏样品溶液，分别用欧洲药典8.0[2]中收载的色谱条件与上述优化后色谱条件分析测定。

结果：由图1、图2比较可见，氧化破坏后的样品采用自研的方法检测可将4个杂质全部检出，而采用欧洲药典方法检出的杂质个数和分离度均较差（本文各图中标号代表：1：杂质B，2：犬尿氨酸，3：N-甲酰犬尿氨酸，4：2-羟基色氨酸，5：色氨酸，6：苯丙氨酸，7：酪氨酸，8：双氧水）。

图1 欧洲药典方法测定氧化后色氨酸溶液色谱图

3.2 专属性

3.2.1 原辅料空白试验 按处方配制除色氨酸以外的各原辅料空白溶液、各杂质混合对照溶液、以及加各杂质对照的混合样品溶液，照2.4和2.5项下色谱条件与测定法测定。

结果：由图3～图5可见，色氨酸的4个杂质在复方氨基酸（15）腹膜透析液的样品中可有效分离，样品中的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸均不影响4个杂质的测定。

图3 杂质对照溶液色谱图

图4 空白溶液色谱图

图5 加杂质对照的混合样品溶液色谱图

3.2.2 破坏性试验 将氨基酸（15）腹膜透析液分别于高温、光照、氧化条件下破坏。

图6 注射液光照破坏色谱图

图7 注射液氧化破坏色谱图

图8 注射液高温破坏色谱图

结果：本方法能良好的分离注射液在光照、高温、氧化条件下降解各杂质，且主峰纯度符合要求。

3.3 复方氨基酸（15）腹膜透析液样品中杂质检测

由图9、图10可见，自制的复方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸的杂质要低于上市品（已上市12个月）中的杂质水平。

图9 氨基酸（15）腹膜透析液上市样品色谱图

图10 氨基酸（15）腹膜透析液自制样品色谱图

3.4 线性范围

分别取2.1项下各对照溶液适量，加水稀释成系列浓度后照2.4和2.5项下色谱条件与测定法进行测定。以峰面积对浓度作回归方程，结果见表2，表明各杂质浓度与峰面积呈良好的线性关系，符合要求。

表2 杂质的标准线性曲线

3.5 检测限、定量限

分别取2.1项下各对照溶液适量，加水连续稀释后照2.4和2.5项下色谱条件与测定法测定，直至信噪比为10:1时，该浓度为定量限浓度；当信噪比为3:1时，该浓度为检出限浓度；配制6份定量限浓度对照混合溶液，连续进样，计算其RSD，应符合要求。6份定量限样品峰面积RSD值小于5 %，保留时间RSD小于2 %。结果见表3。

表3 杂质的检测限和定量限

3.6 精密度

重复性试验：取2.2项下混合样溶液，照2.4和2.5项下色谱条件与测定法，测定6份样品中杂质B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羟基色氨酸的含量。结果表明，6份样品中杂质B平均含量为0.5362 μg/ml，RSD为4.6 %，犬尿氨酸平均含量为0.5399 μg/ml，RSD为0.8 %，N-甲酰犬尿氨酸平均含量为0.5216 μg/ml，RSD为2.6 %，2-羟基色氨酸平均含量为0.5488 μg/ml，RSD为2.2 %。

表4 重复性试验结果

中间精密度试验：取2.2项下混合样溶液，照2.4和2.5项下色谱条件与测定法，由不同的仪器、试验人员测定相同的6份样品杂质含量，计算12份样品的RSD值。结果表明，12份样品中杂质B平均含量为0.5154 μg/ml，RSD为6.6 %，犬尿氨酸平均含量为0.5197 μg/ml，RSD为4.2 %，N-甲酰犬尿氨酸平均含量为0.5248 μg/ml，RSD为3.0 %，2-羟基色氨酸平均含量为0.5406 μg/ml，RSD为4.1 %。

结论：由上述重复性试验与中间精密度试验结果可知，该方法精密度良好。

3.7 稳定性试验

取2.1项下各对照溶液，照2.4和2.5项下色谱条件与测定法，分别于0，4，8，12，24 h取样测定其稳定性。结果杂质B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸和2-羟基色氨酸的样品峰面积RSD分别为1.9 %，0.9 %，1.1 %和0.7 %。

3.8 回收率

精密量取2.1项下各对照溶液适量，按照低、中、高3个浓度稀释配制含有4种杂质的溶液，每个浓度配制3份，共配制9份样品溶液，其中低浓度为定量限浓度。照2.4和2.5项下色谱条件与测定法。结果杂质B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸和2-羟基色氨酸的平均回收率分别为101.78 %，106.31 %，104.86 %和100.71 %。详见表5～8。

表5 杂质B回收率试验结果（n=9）

表6 犬尿氨酸回收率试验结果（n=9）

表7 N-甲酰犬尿氨酸回收率试验结果（n=9）

表8 2-羟基色氨酸回收率试验结果（n=9）

3.9 耐用性

分别考察流动相比例、流动相pH值、柱温、检测波长、流速不同色谱柱等方法因素发生变化时，该方法的耐受程度。每个条件下各测试2次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0 %，杂质含量的绝对值在±0.1 %以内。

结果表明，上述各影响因素变化条件下，除流速为0.6 ml/min时分离度最小为1.43，其余各条件理论塔板数均大于10 000，分离度均大于1.5。犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸各影响因素条件下6份含量数据RSD值小于2.0 %，杂质B略过，最高RSD值为7.1 %，但对有关物质测定结果无明显影响。

综合上述，该方法空白原辅料无干扰，有关物质能够实现良好的分离，专属性强；定量限浓度均低于0.05 %，该方法灵敏度高；准确度、精密度良好，各杂质自定量限浓度至0.5 %范围内浓度与峰面积成良好的线性关系；溶液在24 h内稳定，能够满足测定需求，系统适用性与耐用性良好。该方法能够满足本品中色氨酸有关物质检测要求。

3.10 样品测定

取自制复方氨基酸（15）腹膜透析液3批及市售产品，照2.4和2.5项下色谱条件与测定法测定。结果见表9。

表9 复方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸降解产物测定结果

4 讨论

欧洲药典收录的检测方法在评价复方氨基酸制剂中色氨酸杂质时，受其他氨基酸组分影响，其专属性差，不能有效检测色氨酸的降解杂质。我们在其方法基础上改进优化了HPLC色谱条件，可对其主要的降解产物进行分离检测，经方法学验证，可用于多种含色氨酸的复方氨基酸制剂工艺和质量评价，希望给研究者提供参考。