基于氧化还原电位的光合细菌补料培养工艺优化

王志华,朱晓雯,何桂霞,王泽建,王永红,庄英萍,*

(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,国家生化工程技术研究中心,上海 200237; 2.上海明锦畜牧养殖有限公司,上海 202150)

光合细菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)是一类以光为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物等作为供氢体进行光合作用的微生物。其拥有合成许多化合物的能力,比如辅酶Q10、维生素B12、5-氨基乙酰丙酸、卟啉、色素等[1-2]。而目前对光合细菌研究的热点之一是其强大的水处理能力,独特的光能异养特性使其能够在高浓度的有机废水中生存,并最终通过代谢将废水中的有机物转化为水生生物生长所需的养料,达到净化水质,促进水体物质循环的目的[3-4]。王国惠[5]从崇明本地土壤中筛选出由深红红螺菌、沼泽红假单胞菌、类球红细菌三种光合细菌组成的优势混合菌群,过往研究表明菌种间的相互作用能够强化降解过程。目前,光合细菌处理污水技术应用的一大障碍是光合细菌生产仍以批培养为主,而将补料技术用于光合细菌培养过程鲜有报道,利用先进传感器技术实时检测来指导优化过程也是解决这类问题的关键[6]。

氧化还原电位(oxidation reduction potential,ORP)作为反映整体电子转移和胞内氧化还原平衡的参数,在一些厌氧或者微好氧发酵过程中被广泛应用[7-9]。虽然ORP检测的原理并不复杂,但是鲜有能够全面系统地解释其与微生物代谢之间关系的报道[10]。pH、溶氧、平衡常数以及培养基中营养物质的利用与产物的生成,均会造成ORP的变化[11]。

本论文将在线ORP监测系统与光合细菌菌群的生长过程相耦合,并希望能够优化补料工艺,最终达到提高菌浓,节约生产成本,为解决此类问题提供一个新的视角的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)以及类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)组成的混合菌 上海明锦畜牧养殖有限公司提供;酵母提取物、琥珀酸钠、柠檬酸铁、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、氯化铵、氯化钙、硫酸锌、氯化锰、硼酸、氯化钴、氯化铜、氯化镍、钼酸钠 分析纯,凌峰化学试剂有限公司(上海)。

ZWY-211C恒温摇床振荡培养柜 智城分析仪器制造有限公司(上海);UV-2102PC紫外可见光分光光度计 菁华科技仪器有限公司(上海);FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器;5L发酵罐 国强生化工程装备有限公司(上海);TGL-16A 台式高速离心机 悦丰仪器仪表有限公司(上海);Agilent 1100 series 高效液相色谱 Agilent 公司(美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 活化培养基:酵母提取物 0.3 g/L、C4H4Na2O42 g/L、FeC6H5O70.005 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.02 g/L、NaCl 0.4 g/L、NH4Cl 0.4 g/L、CaCl20.05 g/L、微量元素SL-6 1 mL/L、琼脂20 g/L pH6.8、121 ℃灭菌20 min。

生长培养基:酵母提取物 0.3 g/L、C4H4Na2O42 g/L、FeC6H5O70.005 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.02 g/L、NaCl 0.4 g/L、NH4Cl 0.4 g/L、CaCl20.05 g/L、微量元素SL-6 1 mL/L、pH6.8、121 ℃灭菌20 min。

微量元素SL-6:ZnSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、H3BO30.03 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuCl·2H2O 0.01 g/L、NiCl2·2H2O 0.02 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.03 g/L。

补料培养基0、补料培养基1、补料培养基2、补料培养基3、补料培养基4、补料培养基5成分分别为:去离子水、C4H4Na2O429 g/L、C4H4Na2O458 g/L、C4H4Na2O487 g/L、C4H4Na2O4116 g/L、C4H4Na2O4145 g/L,pH6.8,于121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 种子液制备 将保存于4 ℃冰箱中的混合菌株取出,涂布于装有活化培养基的斜面,于28 ℃光源功率40 W培养24 h,连续培养三代完成活化。用60 mL无菌水将菌悬液从斜面洗脱接入装有400 mL生长培养基的透明培养瓶中,于28 ℃光源功率40 W培养24 h备用。

1.2.3 光合细菌菌群批培养的代谢参数采集 将种子液和生长培养基按1∶4 (V/V)接入5 L发酵罐中,装液量为4.5 L。初始pH调为6.8,转速设为150 r/min,于28 ℃光源功率40 W培养144 h,每12 h取一次样,测定OD660、菌体干重、琥珀酸浓度,记录ORP值。

1.2.4 不同速率的碳源流加对光合细菌菌群生长的影响 将种子液和生长培养基按1∶4 (V/V)接入5 L发酵罐中,装液量为4.5 L。初始pH调为6.8,转速设为150 r/min,于28 ℃ 光源功率40 W培养144 h。于60 h开始分别补入补料培养基0、补料培养基1、补料培养基2、补料培养基3、补料培养基4、补料培养基5,每小时补入体积为3 mL,即补入琥珀酸钠流速分别为:0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g·(L·h)-1。每12 h取一次样,测定OD660、菌体干重、琥珀酸浓度,记录ORP值。

1.2.5 基于ORP反馈控制的间歇补料培养工艺 将种子液和生长培养基按1∶4 (V/V)接入5 L发酵罐中,装液量为4.5 L。初始pH调为6.8,转速设为150 r/min,于28 ℃ 光源功率40 W培养144 h。将补料过程与ORP变化相耦合,将ORP开始上升视为补料的起点,补入培养基4,每小时补入体积为3 mL,补入速度即0.08 g·(L·h)-1,当5 L罐中琥珀酸浓度达1 g/L时停止。ORP开始上升时再次开启补料,不断重复上述过程,直至培养过程结束。每6 h取一次样,测定OD660、菌体干重、琥珀酸浓度,记录ORP值。

1.3 指标的测定与计算

1.3.1 ORP测定 采用ORP电极(EASYFERM PLUS K8 RX 325,Hamilton)进行测定。

1.3.2 吸光度(OD660)测定 菌浓由吸光度(OD660)表示,将菌液适当稀释后于波长660 nm处测定吸光值,以空白生长培养基为对照。菌体的光密度值(OD660)=OD660×稀释倍数[12]。

1.3.3 菌体干重(DCW)测定 取10 mL培养液10000 r/min离心10 min,用去离子水洗涤菌体两次,经0.22 μm滤膜抽滤洗涤液后,留菌体,放入烘箱105 ℃烘24 h,称重[13]。

1.3.4 琥珀酸钠测定 Agilent 1100 HPLC系统,色谱柱:AquaSeq公司C18柱。样品前处理:取10 mL培养液,7500 r/min 4 ℃离心10 min,取1.5 mL上清液4 ℃ 12000 r/min离心15 min,再取上清液用0.22 μm的膜过滤,滤液于-20 ℃保存待用。流动相:3 mmol H2SO4溶液;流速:0.4 mL/min。进样量:20 μL。柱温:50 ℃。检测波长:215 nm[14]。

1.3.5 平均比生长速率的计算 平均比生长速率计算公式:

式(1)

式中:μ:平均比生长速率,1/h;N1:培养结束时菌浓,g/L;N0:培养前菌浓,g/L;t:培养时间,h。

1.3.6 琥珀酸利用效率的计算 琥珀酸钠利用效率计算如下:

式(2)

式中:n:琥珀酸利用效率,gDCW/g;S0:培养前琥珀酸钠浓度,g/L;Sc:过程中补入的琥珀酸钠浓度,g/L;N1:培养结束时菌浓,g/L;N0:培养初期菌浓,g/L。

1.4 数据处理

所有实验均重复三次,数据采用Origin 2016进行处理。

2 结果与分析

2.1 光合细菌菌群分批培养的代谢变化

光合细菌发酵过程中ORP、OD660以及碳源随时间变化规律如图1所示。0～60 h,ORP值由152 mV降至-167 mV,此时培养环境由氧化状态转为还原状态。这与混合菌群均为兼性厌氧混合菌群的好氧生长有关。60 h后,ORP开始上升,至培养结束上升至-19 mV。培养前12 h,菌体处于延滞期;12～36 h进入快速增长阶段,OD660值由0.37增长至1.31。36 h后菌群增长有所减缓,72 h之后菌浓不再上升,维持在1.70～1.80。琥珀酸钠的最初浓度为1.60 g/L,60 h后浓度仅为0.178 g/L。基于光合菌群各参数间的相关性分析,ORP的下降基本与菌体的生长过程耦合,而在菌体生长停滞之后,ORP开始出现回升。根据主要碳源—琥珀酸钠的浓度检测结果,分析菌群停止快速增长可能是由于碳源不足所致。因此,考虑将表观参数—ORP作为描述菌体生长过程中碳源消耗的信号,而其在生长后期的上升可能是碳源不足导致菌体停止增长。

图1 光合细菌相关代谢参数的变化Fig.1 Changes in metabolic parameters related to photosynthetic bacteria

2.2 不同碳源流加速率对光合细菌菌群生长的影响

2.1的实验结果表明,批次培养至一定阶段,ORP不再下降的信号可作为主要碳源不足的预警。为了延长光合细菌的生长时间以提高其培养浓度,进行了琥珀酸钠连续补料实验,以考察不同浓度的琥珀酸钠对光合细菌后期生长的影响。5个实验组中,当琥珀酸钠补入之后,菌体均恢复了生长(图2),证明批培养60 h后主要碳源不足是限制光合细菌进一步生长的重要因素。

从图2中由补加速度的差异导致的不同底物浓度积累对菌体后期生长的影响也具有明显差异。当碳源浓度过低时,菌体的代谢活性会由于所需营养物质得不到满足而受到抑制,导致菌体生长缓慢;当碳源浓度过高时,细胞内外的渗透压会增大,使酶的活性受到抑制,进而影响菌体的生长代谢[15]。如图2所示,当流加琥珀酸钠的速度为0.02、0.04 g·(L·h)-1时,琥珀酸钠进入发酵体系后迅速被消耗,仅在发酵后期有较小浓度的累积。而当流加琥珀酸钠的速度为0.06、0.08和0.10 g·(L·h)-1时,流加开始后,发酵液中的琥珀酸钠积累明显,至培养结束时,发酵罐中琥珀酸钠含量浓度已分别达2.05、6.58和7.30 g/L。如表1所示,当补料浓度为0.08 g·(L·h)-1时,发酵终点,即144 h时,OD660最大,达3.034,整个培养周期内菌体的平均比生长速率最高，为0.018 h-1。

图2 不同碳源的补加速度流加对光合菌群生长的影响Fig.2 Effect of supplementary acceleration flow of different carbon sources on the growth of PSB注:(a):空白;(b):0.02 g·(L·h)-1;(c):0.04 g·(L·h)-1;(d):0.06 g·(L·h)-1;(e):0.08 g·(L·h)-1;(f):0.10 g·(L·h)-1。

表1 不同补料策略下光合细菌生长的参数Table 1 Parameters of PSB cultivation under different feeding strategy

2.3 基于ORP反馈控制的间歇补料培养工艺

当补入碳源的流速为0.08 g·(L·h)-1时,发酵终点可获得最高的菌群密度。发酵至60 h时,ORP开始上升,开始启动补料,直至发酵液中琥珀酸钠浓度达1 g/L左右,补料停止。图3所示,首阶段补料开始时间为60 h,至78 h达到所设定阈值。期间琥珀酸的浓度由0.18 g/L上升至1.146 g/L,ORP停止上升恢复下降趋势。当培养过程进行至90 h,ORP上升、OD660停止增长,且琥珀酸浓度已经降至0.19 g/L。经过首阶段补料操作,OD660由1.70升至2.67,ORP由-158 mV降至-290 mV,补入琥珀酸钠即将耗完。

图3 基于ORP补料工艺下对光合细菌代谢参数Fig.3 Parameters of PSB cultivation under feeding strategy based on ORP value

90 h进行第二阶段补料操作,于105 h左右到达设定的琥珀酸钠浓度阈值。补入碳源之后,光合细菌再次恢复生长,直到126 h。在第二次补料过程中,OD660由2.68增加至3.82,ORP由-290 mV降至-341 mV。同理,进入第三次补料阶段。第三阶段经历时间比较短,因为此时已经接近光合细菌的生长末期,138 h,ORP不再上升,OD660开始下降,说明菌群已经停止生长,最终OD660为4.12。表2可以看出,相比于连续的底物流加培养(0.08 g·(L·h)-1),基于ORP的补料工艺将平均比生长速率由0.018提升至0.019,生物量提高57%,琥珀酸钠利用效率从0.119 gDCW/g提高至0.262 gDCW/g。

表2 不同条件下光合细菌生长参数Table 2 Growth parameters of PSB under different situation

3 结论

本实验将在线ORP技术用于光合细菌的补料培养过程,对光合细菌的补料培养进行优化。将ORP开始回升作为菌体因缺少碳源而停止生长的信号。分别在在60、90、126 h以0.08 g·(L·h)-1的速度补入琥珀酸钠,菌体干重由0.60 g/L提高至0.94、1.16 g/L,最后达1.46 g/L。相对于批培养,补料工艺省去了放料、清洗发酵罐、灭菌、配料等步骤,提高了设备的利用率。而基于ORP反馈控制的间歇补料培养工艺进一步提高生产效率,降低生产成本。