脱脂牛乳体系中乳蛋白葡萄糖美拉德反应程度及产物功能性质研究

牟全生,杨 敏,王裕成,包鹏杰,雷敬敬,陈 浩,王海霞,杨继涛

(甘肃农业大学理学院,农业资源化学与应用研究所,甘肃兰州 730070)

牛乳是人类膳食中完美的食品之一,其天然营养的特性被消费者所青睐。牛乳含有人体所需的全部氨基酸、丰富的矿物质和维生素等。蛋白质是牛乳的重要营养成分,乳蛋白主要包括两大类,酪蛋白和乳清蛋白,其含量比例约为4∶1[1]。酪蛋白及其制品有着较高的营养价值和良好的功能特性,可用作乳化剂、增稠剂和营养强化剂等,在食品工业、化学工业和医药工业等行业广泛应用[2-4]。乳清蛋白是紧密的球状蛋白,其功能特性广泛,胆固醇、脂肪和乳糖含量低,易消化吸收,生物利用价值极高,常用作营养强化剂[5]。

蛋白质结构决定其功能性质,可通过物理、化学、酶法修饰改变蛋白质的结构,从而改变其性质。化学修饰常用于改善蛋白质的功能性质,其主要方法有酰化、酯化、糖基化、磷酸化和烷基化等[6-7]。其中,以美拉德反应(Maillard reaction)为途径的蛋白质糖基化修饰,近年来被众多的研究者用于改善蛋白质的功能性质。美拉德反应是还原糖的羰基和蛋白质的ε-氨基之间的复杂反应,其产物具有特殊的香气、颜色,并具有抗过敏、抑菌、抗氧化的特性[8-9]。

近年来,关于乳蛋白的糖基化产物性质研究主要集中在生物活性方面。众多研究指出,酪蛋白-糖的美拉德反应产物(Maillard reaction products,MRPs)具有降血脂、抗炎、抗肿瘤及降血压作用[10-14]。另外,糖基化修饰显著改善了酪蛋白的抗氧化性,具体表现为DPPH自由基清除活性提高,还原力增强[12,15-16]。然而,以脱脂牛乳为体系的糖基化产物功能性质研究鲜有报道。

本文以脱脂乳为研究对象,以葡萄糖为糖基化试剂,采用水热法进行美拉德反应,系统研究了脱脂牛乳在不同葡萄糖添加量下的反应程度,分析了糖基化产物的主要功能性质,以期为脱脂乳的糖基化修饰和糖基化乳蛋白的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牛乳 采自甘肃省兰州市安宁区营门村牛奶厂;葡萄糖 烟台市双双化工有限公司;邻苯二甲醛(OPA) 阿拉丁试剂有限公司;十二烷基硫酸钠(SDS) 烟台市双双化工有限公司;大豆油 陕西省咸阳市;四硼酸钠 天津市化学试剂三厂;β-巯基乙醇 天津市凯信化学工业有限公司。

3K-15高速冷冻离心机 德国Sigma公司;JJ224BC型电子天平 常熟市双杰测试仪器厂;PHS-3CpH计 上海三信仪器厂;TU-1901-双光束紫外可见分光光度仪 北京普析通用仪器有限责任公司;真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;AD500S-H均质机 上海昂尼仪器仪表有限公司;Bettersize 2000激光粒度仪 丹东百特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脱脂乳制备 取新鲜牛乳经3层纱布过滤除杂后,在25 ℃、4000 r/min的条件下离心20 min,除去上层脂肪,得到下层脱脂乳;加入0.02%(w/v)叠氮化钠,防止微生物生长,并在4 ℃下保存备用。

1.2.2 脱脂乳-葡萄糖美拉德反应物制备 移取100 mL脱脂乳于水热反应釜中,用1 mol/L NaOH将溶液的pH调节至9.0,分别加入0、1、1.5、3、6、9 g葡萄糖,搅拌均匀后在100 ℃下加热3 h。结束后,将样品立即置于冷水浴中冷却。反应后的脱脂乳-葡萄糖混合物即为美拉德反应产物。取适量反应产物,用于糖基化程度测定;将剩余反应产物在4 ℃下采用蒸馏水透析(分子截留量为1.0 kDa)48 h,并冷冻干燥,备用。

1.2.3 糖基化程度测定 根据文献[12]方法,取400 μL反应后的样品,用pH7.0磷酸盐缓冲液稀释18倍,取100 μL稀释后的样品与3 mL邻苯二甲醛试剂混匀,室温下暗室放置5 min,以3 mL邻苯二甲醛试剂与100 μL蒸馏水的混合液为参比,采用紫外-可见分光光度计在340 nm测定吸光值,计算糖基化程度,公式如下:

糖基化程度(%)=(A0-A)×100/A0

式中,A0和A分别为反应前和反应后的样品340 nm下的吸光值。

1.2.4 体系pH测定 采用pH计测定反应结束后体系的pH[17]。

1.2.5 中间产物和褐变程度测定 参考文献[18]方法,准确移取20 μL反应后的溶液,用蒸馏水稀释360倍,采用紫外-可见分光光度计在294 nm下测定吸光值,表示中间产物含量;准确移取200 μL反应后的溶液,用蒸馏水稀释36倍,采用紫外-可见分光光度计在420 nm下测定吸光值,表示褐变程度。

1.2.6 酪蛋白粒径测定 将反应后的样品适度稀释后采用激光粒度仪测定样品中酪蛋白胶束粒径(D43),泵速1800 r/min,颗粒折射率1.46,分散剂折射率1.33,吸收参数0. 001,测定3次,取平均值。

1.2.7 乳化性及乳化稳定性测定 参考文献[19]方法,准确称取冻干后的样品0.2 g,用0.2 mol/L pH7.0磷酸缓冲液定容至100 mL(浓度为2 mg/mL);取24 mL稀释液与8 mL大豆油混合,10000 r/min转速下高速分散处理1 min形成均一的乳状液;分别在0、10和30 min时从底部取50 μL液体,并与5 mL质量浓度为1 g/L的SDS溶液混匀,采用紫外-可见分光光度计在500 nm处测定吸光值,以SDS溶液作参比。乳化活力指数和乳化稳定性计算公式如下。

乳化活力指数EAI(m2/g)=(2×2.303×A0×D)/[C×(1-θ)×φ×103]

乳化稳定指数ESI(%)=A10/30×100/A0

式中:D为稀释倍数(100);C为乳状液形成前溶液中蛋白质的浓度(2 g/mL);θ为乳状液中油相体积分数(0.25);φ为比色皿直径(1 cm);A0为0 min吸光值;A10/30为乳液静置10或30 min的吸光值。

1.2.8 发泡性及泡沫稳定性的测定 参考文献[19]方法,准确称取1 g 冻干后的样品,用0.2 mol/L pH7.0磷酸缓冲液溶解定容至100 mL,取30 mL样品溶液置于50 mL烧杯中,于10000 r/min均质1 min。分别于均质后0、5、10、30 min读取泡沫体积。

发泡性(%)=(V0/Va)×100

泡沫稳定性(%)=(Vi/V0)×100

式中:V0为均质后0 min时泡沫体积;Vi为分别表示放置5、10、30 min时的泡沫体积;Va为均质前样品溶液总体积。

1.2.9 吸油性的测定 参考文献[19]方法,准确称取0.5 g冻干后的样品,加入5 mL大豆油于称过质量的15 mL离心管中涡旋混合5 min,静置2 h后于4000 r/min下离心30 min,将上清液轻轻倒出,称量离心管和沉淀的质量。

吸油性(g油/g糖基化蛋白质)=离心后沉淀质量/MRPs初始质量

1.3 数据处理

各组数据均为3次实验的平均值±标准偏差,采用SPSS 18.0(SPSS Inc.,USA)进行显著性分析,采用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 脱脂乳-葡萄糖美拉德反应程度及体系pH分析

脱脂乳与葡萄糖的美拉德反应程度和体系pH变化如图1所示。由图1可知,随着葡萄糖添加量的增加,脱脂乳中蛋白质的糖基化程度显著增大(p<0.05);当葡萄糖添加量达到3 g/100 mL脱脂乳时,糖基化程度达到最大值,之后随着葡萄糖添加量的增加而降低。在不添加葡萄糖的情况下,脱脂乳经加热后糖基化程度为9.22%±1.28%,这是由于乳中含有的乳糖与乳蛋白发生了美拉德反应。乳蛋白糖基化程度较低与乳糖含量有关。当添加一定量的葡萄糖时,还原糖含量增大,从而有大量氨基被糖基化,糖基化程度随糖添加量的增大而增大。另一方面,在加热过程,脱脂乳中乳清蛋白变性并与酪蛋白共价结合,致使乳蛋白发生不可逆热聚集[20],从而使游离氨基被包埋而大幅度减少。糖基化程度以游离氨基含量为依据,因此糖基化程度较高,且随葡萄糖添加量的增大而显著增加(p<0.05)。当葡萄糖含量大于3 g/100 mL脱脂乳时,大量的还原糖与乳蛋白相互作用,影响了酪蛋白胶束结构,抑制了胶束解离[21]或美拉德反应产物的热聚集,使游离氨基含量增加,反应程度降低。有关乳蛋白糖基化反应的报道指出,蛋白质糖基化程度随还原糖添加量的增加而增大,当糖添加量过高时,糖基化程度缓慢增加,甚至不再发生显著变化[22],这与本文研究结论不一致,原因在于文献所用原料是单一乳蛋白,而本研究采用脱脂乳。相比而言,脱脂乳体系复杂,添加葡萄糖且高温长时间加热时,体系中除了美拉德反应,还产生酪蛋白胶束的解离和聚集、乳清蛋白的自聚、乳清蛋白和酪蛋白的共价聚集、美拉德反应产物的相互聚集等,从而影响糖基化反应过程及反应程度。

就反应体系pH而言,与不添加葡萄糖体系相比,当乳体系中添加葡萄糖时,糖基化反应过程中生产小分子有机酸,使反应后体系pH迅速降低[16]。然而,随着葡萄糖含量的增加,体系pH降低至6.9左右,不再发生显著变化(图1)。这是由于反应体系pH降低至接近中性时,美拉德反应受到抑制,因而生成的小分子酸含量变化不明显。

图1 葡萄糖添加量对脱脂乳糖基化程度和体系pH的影响Fig.1 Effects of glucose concentration on glycosylation degree and pH of skim milk-glucose system注:不同字母表示差异显著(p<0.05);图2～图7同。

2.2 脱脂乳-葡萄糖美拉德反应中间产物和褐变程度分析

294 nm波长处吸光度主要用于反映蛋白质糖基化过程中产生的无色中间产物,如糖、醛和小分子酮等;吸光度越大,中间产物越多[14,18]。由图2可以看出,随着葡萄糖添加量的增加,中间产物含量先增加再降低,且变化幅度较小。当葡萄糖添加量增加到3 g/100 mL时,中间产物量达到最低值,之后显著上升(p<0.05)。

图2 葡萄糖添加量对脱脂乳-葡萄糖体系反应中间产物的影响Fig.2 Effect of glucose concentration on the amount of intermediate products of skim milk-glucose system

类黑素是美拉德反应终产物之一,其呈现褐色,在420 nm波长处具有较强的吸收,因此可用该波长下的吸光度表征褐变程度[14,23]。由图3可知,不添加葡萄糖时,脱脂乳中的乳糖与酪蛋白发生了美拉德反应,产生少量类黑素。随着葡萄糖添加量的增大,类黑素的产量降低,且变化不显著(p<0.05)。当葡萄糖添加量增加到大于3 g/100 mL时,类黑素含量显著上升(p<0.05)。

图3 葡萄糖添加量对脱脂乳-葡萄糖美拉德反应褐变程度的影响Fig.3 Effect of glucose concentration on the browning intensity of skim milk-glucose system

类黑素是高级阶段反应产物经聚合、异构等反应后形成的大分子含氮聚合体[16],其产量与中间产物的累积量有关。随着葡萄糖添加量的增大,中间产物的量和类黑精产量变化趋势基本一致。有研究指出,葡萄糖与氨基酸上的氨基反应生成的脱氧果糖基氨基酸复合物是美拉德反应的中间产物,该物质可进一步转化为不同产物:一种途径下转化为1-脱氧葡萄糖醛酮和3-脱氧葡萄糖醛酮,然后进一步转化为类黑素或小分子酸等;另一种途径下转化为丙酮醛等;上述两种转化途径和转化程度受到温度、pH等多种因素的影响[24]。与脱脂乳相比,当添加葡萄糖1 g/100 mL时,体系美拉德反应程度增大,pH迅速降低(图1),可见中间产物主要转化为小分子酸,因此类黑素产量降低(图3)。当葡萄糖添加量为1.5～3 g/100 mL时,体系糖基化程度继续增大,pH低于7.0,说明中间产物主要转化为小分子酸,还可能生成了丙酮醛等物质,因此中间产物累积量和类黑素产量变化不显著。当葡萄糖添加量大于3 g/100 mL脱脂乳时,体系pH略低于6.9,说明随着葡萄糖添加量的增大,中间产物首先转化为小分子酸,降低了体系pH;当体系pH低于6.9时,弱酸性环境可能抑制了中间产物向小分子酸的转化,使其主要转化为类黑素,且出现累积,因此表现为中间产物和类黑素含量随着糖添加量的增加而迅速增大。

有文献指出,酪蛋白肽和葡萄糖美拉德反应中间产物含量随葡萄糖添加量的增加而增大[22],与本文研究结论不一致,原因可能是参与反应的蛋白质不一致,乳体系成分多而复杂,体系成分间的相互作用,如矿物质与蛋白游离氨基的结合作用、大量葡萄糖与乳蛋白的相互作用等,都将影响美拉德反应途径,具体影响机理和影响程度有待进步一研究。

2.3 脱脂乳-葡萄糖美拉德反应体系中酪蛋白粒径分析

乳中酪蛋白以胶束态存在,其粒径主要分布在100～200 nm之间[25]。脱脂乳-葡萄糖美拉德反应体系里酪蛋白胶束粒径如图4所示。脱脂乳经过水热法加热后,酪蛋白胶束平均粒径为164 nm。加入葡萄糖后,酪蛋白胶束粒径增大。当葡萄糖添加量小于3 g/100 mL脱脂乳时,酪蛋白胶束粒径与未添加葡萄糖相比显著增加(p<0.05)。结合糖基化程度可以看出,添加葡萄糖后脱脂乳的糖基化程度迅速增大,因此粒径迅速增大;另外,高温下乳蛋白糖基化产物可能发生热聚集,致使粒径增加。

图4 脱脂乳-葡萄糖美拉德反应体系中酪蛋白胶束粒径Fig.4 Particle sizes of casein micelles in skim milk-glucose Maillard reaction system

当葡萄糖添加量达到3 g/100 mL脱脂乳时,虽然糖基化程度达到最大值,但粒径却降低至未添加葡萄糖的水平。而且,在该添加量下,中间产物和类黑素的产量均为最低值。有文献指出,当还原糖添加量较高时,可与酪蛋白胶束产生氢键等相互作用,其显著抑制酪蛋白胶束的解离,而且阻止了胶束相互聚集[21]。由此推断,该添加量下,糖基化后酪蛋白胶束的热聚集被抑制,胶束形成较为致密的结构,游离氨基被包埋在胶束内部,所以糖基化程度较高,粒径较小。之后,随着葡萄糖添加量的进一步增加,类黑素产量迅速增大(图3),所以体系中微粒的平均粒径也随之有所增大。

2.4 脱脂乳-葡萄糖美拉德反应产物的乳化性分析

蛋白质是双亲分子,能在油-水界面上形成吸附层,从而降低界面张力,因而具有乳化活性。脱脂乳-葡萄糖美拉德反应产物的乳化活性和乳化稳定性如图5所示。由图5A可以看出,与未添加葡萄糖的样品相比,添加葡萄糖后,脱脂乳-葡萄糖美拉德反应产物的乳化活性显著增大(p<0.05),但其随糖添加量的增加而基本不变(p>0.05)。当糖添加量大于3 g/100 mL脱脂乳时,该体系的乳化活性接近未添加葡萄糖的水平(p>0.05)。

蛋白质的乳化稳定性是影响其应用范围的另一个关键因素。乳化稳定性取决于其亲水性和疏水性平衡,亲水性过高或疏水性过高都将导致乳化稳定性较差[18]。由图5B可知,随着葡萄糖添加量的增加,产物10、30 min乳化稳定性在葡萄糖添加量为3 g/100 mL时显著提高(p<0.05);除了葡萄糖添加量为3 g/100 mL脱脂乳以外,30 min乳化稳定性变化不显著(p>0.05)。

图5 葡萄糖添加量对酪蛋白-葡萄糖美拉德反应产物乳化活性和乳化稳定性的影响Fig.5 Effects of glucose concentration on the emulsifying activity and emulsion stability of skim milk-glucose Maillard reaction products注：A、B分别为脱脂乳-葡萄糖美拉德反应产物的乳化活性和乳化稳定性。

美拉德反应使蛋白质亲水性增强,其在油相和水相界面可以更加有序紧密的排列,从而形成更为致密的蛋白膜,因此其乳化性得以提高[26]。但是,葡萄糖添加量过大时,生成大量中间产物和类黑精,这些物质本身不具备蛋白质的双亲性质,所以体系乳化活性降低。由此可见,适度糖基化修饰有利于改善乳蛋白的乳化活性和乳化稳定性,以葡萄糖添加量为3 g/100 mL脱脂乳时较为适宜。

2.5 脱脂乳-葡萄糖美拉德反应产物的发泡性分析

蛋白质在激烈搅拌的情况下可以迅速吸附到气相和水相的界面,同时蛋白质分子能够迅速适应环境而改变自身构象,重新在气相与水相界面排列,形成有序的分子层或蛋白质膜[27]。如图6A所示,随着葡萄糖添加量的增加,脱脂乳体系美拉德反应产物的发泡性缓慢增大;当添加量达到3 g/100 mL时稍有降低,之后基本不再发生变化。就泡沫稳定性而言(图6B),糖基化使脱脂乳体系10和30 min泡沫稳定显著增加(p<0.05),但其并未随葡萄糖添加量增加而显著变化(p>0.05)。

图6 葡萄糖添加量对酪蛋白-葡萄糖美拉德反应产物发泡性和泡沫稳定性的影响Fig.6 Effect of glucose concentration on the foaming capacity and foam stability of skim milk-glucose Maillard reaction products注：A、B分别为脱脂乳-葡萄糖美拉德反应产物的发泡性和泡沫稳定性。

泡沫稳定性与蛋白质流体力学半径和分子量有关,还与带电基团有关[28-29]。脱脂乳中蛋白质与葡萄糖的共价结合降低了氨基含量,引入了大量羟基,使蛋白质分子亲水性增加,改变了蛋白质分子空间结构,从而改变了分子间的作用力,使得空气-水界面的蛋白质膜厚度和硬度得到增加,进而提高了泡沫稳定性。由此可见,适度糖基化修饰可提高乳蛋白的发泡性能和泡沫稳定性。

2.6 脱脂乳-葡萄糖美拉德反应产物的吸油性分析

吸油性是蛋白质的另一重要功能性质,其主要依靠蛋白分子结构对油的物理拦截作用,蛋白质体积密度越小,吸油性越大;吸油性还与蛋白质疏水性、结构等有关[30]。如图7所示,脱脂乳-葡萄糖美拉德反应产物吸油性随糖浓度的增加呈减小趋势。糖基化反应导致乳蛋白分子发生交联和聚合,形成大分子聚合物,增加了蛋白质分子的体积密度,使其结构变得致密,因此对油分子的持有能力降低。所以,糖基化修饰不利于改善乳蛋白的吸油性。

图7 葡萄糖添加量对酪蛋白-葡萄糖美拉德反应产物吸油性的影响Fig.7 Effect of glucose concentration on the oil absorption of skim milk-glucose Maillard reaction products

3 结论

以葡萄糖为还原糖,通过美拉德反应修饰脱脂乳中乳蛋白结构,发现在葡萄糖添加量为3 g/100 mL时,糖基化程度达到最大值,之后迅速降低;而中间产物和褐变程度均在该添加量下达到最低值,之后迅速上升。就反应体系pH而言,并未随葡萄糖添加量的增加而显著变化。糖基化反应后,酪蛋白胶束粒径增加。

糖基化修饰可提高脱脂乳体系的乳化活性和乳化稳定性,当葡萄糖添加量为3 g/100 mL时,两者均实现最大程度的改善。糖基化修饰虽然对脱脂乳中蛋白质的发泡性提高程度并不显著,但其10和30 min泡沫稳定性显著增加(p<0.05)。然而,糖基化修饰并不能改善乳蛋白的吸油性,反而使其降低。

综上所述,可通过糖基化修饰改善乳体系的乳化性和发泡性,使其更利于工业化应用。