反复卤煮对鸭胸肉和卤汤中杂环胺及其前体物的影响

王 震,张雅玮,钱 烨,尹 敬,周光宏,徐幸莲,彭增起

(南京农业大学食品科学与技术学院,食品安全与营养协同创新中心,江苏南京 210095)

杂环胺(heterocyclic amines,HCAs)是在肉类加热过程中由肌酸、氨基酸、葡萄糖等前体物生成的一类杂环化合物,这些杂环化合物有些具有芳香性,所以又称杂环芳香胺(heterocyclic aromatic amines,HAAs)。杂环胺广泛存在于油炸、卤煮、烧烤等高温加热肉制品中。杂环胺不仅对试验动物存在致癌性[1],也可能增加人类患癌风险。流行病学的研究显示,人类结肠癌[2]、前列腺癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]等癌症可能与杂环胺的长期摄入有关。

卤煮是我国传统肉制品生产中经常使用的加工方法,反复使用的卤汤俗称老汤。老汤富含游离氨基酸、核苷酸等可溶性滋味物质,进而赋予肉制品醇厚的滋味[6]。卤煮是盐水鸭生产工艺中的一个重要工序,部分生产者用老汤卤煮盐水鸭,以提高盐水鸭的滋味。然而,老汤反复使用过程中,鸭肉中的肌酸、氨基酸、葡萄糖等可溶性物质不可避免地富集,为杂环胺的生成提供丰富的前体物;加热时间不断延长,进一步促进了杂环胺的生成。目前,关于杂环胺与前体物的关系的研究主要集中于模型体系[7-9]以及烧烤肉等特定肉制品[10-11],而具有中国特色的老汤及盐水鸭中杂环胺与前体物变化规律的研究尚未见报道。

本文以带皮鸭胸肉为原料,模拟盐水鸭的生产过程,研究卤汤使用次数对鸭肉及卤汤中杂环胺及其前体物含量的影响,为进一步抑制反复卤煮过程中杂环胺的生成以及老汤的科学使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻带皮鸭胸肉 山东超和食品有限公司;食用盐、八角、花椒、姜粉等 南京市卫岗农贸市场;12种杂环胺标准品:2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(MeIQ)、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(7,8-DiMeIQx)、9H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Norharman)、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Harman)、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-P-2)、3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Trp-P-1)、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(AαC)和2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(MeAαC) 加拿大Toronto Research Chemicals公司;生化纯肌酸 上海楷洋生物技术有限公司;葡萄糖试剂盒GAGO20-1KT、L-色氨酸标准品 Sigma-Aldrich公司;磺基水杨酸、正己烷、对二甲氨基苯甲醛、硫酸、亚硝酸钠、三氯乙酸、乙醚、丁二酮、1-萘酚、氢氧化钠等 均为国产分析纯。

AL104型电子天平 瑞士Mettler Toledo公司;SBEQ-CR1012型固相萃取装置 德国CNW公司;Waters 2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司;L-8900型氨基酸自动分析仪 日本HITACHI公司;T25高速匀浆机 德国IKA公司;8010S型高速组织捣碎机 美国WARING公司;丙基磺酸固相萃取柱(Bond Elut® PRS柱,500 mg/3 mL) 美国Agilent Technologies公司;C18固相萃取柱(SupelcleanTM LC-18柱,500 mg/3 mL) 美国Supelco公司;Extrelut® NT空柱及填充料硅藻土 德国Merck公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 鸭胸4 ℃下解冻,将解冻后的带皮鸭胸肉去除表面筋膜,修整为形状约12 cm×8 cm×2 cm、重(150±5) g的长方块。鸭胸的处理参照盐水鸭生产工艺[12]并做适当简化,具体如下:

炒盐:称取食盐1 kg,花椒2 g,八角1 g,同时下锅炒制,文火炒制并不断翻炒,炒至食盐呈粉状且辅料香脆。

干腌:炒盐用量为50 g/kg鸭胸肉,均匀涂抹于鸭胸表面后置于4 ℃条件下腌制4 h。

熬卤:10 kg水中加入2.5 kg炒盐、100 g葱、200 g姜和100 g八角,煮沸1 h后自然冷却并捞出香辛料。

复卤:将干腌后的鸭胸以1∶3的料液比置于第3步熬制好的卤水中复卤,4 ℃下湿腌4 h。为保证鸭胸样品的一致性,复卤所用的卤水不重复使用,卤水不足时,按熬卤步骤所述重新制备卤水。

煮制:不锈钢锅中加入2.0 L蒸馏水、3 g生姜粉、2 g八角和20 g食盐,用电磁炉煮沸后加入3块复卤后的鸭胸并开始计时,煮制1 h后捞出。撇去卤汤表面浮油和香辛料后加水补充至2 L并加入0.6 g姜粉、0.4 g八角、4 g食盐,煮沸后重新加入3块复卤后的鸭胸进行下一轮卤煮,卤煮过程保持水微沸,直至卤汤重复使用40次。取第0、1、10、20、30、40次的鸭胸及对应的卤汤40 mL,冷却至室温后,将鸭胸皮层去除并用组织捣碎机将鸭肉捣碎,将肉和卤汤真空包装后置于-80 ℃下冻藏待测。

1.2.2 肌酸的测定 肌酸的测定参照Polak等[13]的方法并稍作修改:在0.5 g鸭肉或1.5 mL卤汤样品中加入50 mL三氯乙酸溶液(30 g/L),充分匀浆后过滤。取20 mL滤液与10 mL乙醚充分震荡以去除脂肪,静置分层后吸取4 mL滤液,加入2 mL丁二酮溶液(0.2 g/L)和2 mL 1-萘酚(25 g/L,以20 g/L的氢氧化钠溶液作为溶剂)于40 ℃水浴5 min。以试剂作空白,测定样品在520 nm处的吸光度。以0、2.5、5、10、25、50 mg/L的肌酸标准溶液在上述条件下反应并测吸光度,得到标准曲线为:y=0.036x-0.0177(R2=0.9991)。

1.2.3 游离氨基酸的测定 利用氨基酸分析仪分析样品中17种游离氨基酸(不含色氨酸)组成。样品前处理条件为:样品置于4 ℃冰箱中解冻12 h后,取4.0 g(或4.0 mL)于离心管中,加入20 mL磺基水杨酸溶液(30 g/L)于10000 r/min下匀浆30 s。匀浆完毕后将离心管于4500 r/min下离心15 min,小心取出,吸取上清液4 mL并加入2 mL正己烷,充分震荡后吸取适量水相,过0.22 μm滤膜后移入进样小瓶中上机测试。

色氨酸的测定方法参考GB/T 15400-94及王健等[14]人的方法并做适当修改:取上述脱脂水层1.0 mL,加入5 mL 1%对二甲氨基苯甲醛(用1∶1的浓硫酸配制),沸水浴3 min后加入0.2 mL 2%亚硝酸钠溶液,继续沸水浴3 min后用水定容到10 mL。以试剂作空白,测定溶液在590 nm处吸光度。以少量0.1 mol/L的氢氧化钾溶液溶解色氨酸标准品后,用水将其配制为20、30、40、50、60、70 μg/mL的色氨酸标准溶液,用同样方法测定其在590 nm处吸光度,并得到标准曲线:y=0.006x+0.0596(R2=0.9983)。

1.2.4 葡萄糖的测定 采用葡萄糖测定试剂盒GAGO20-1KT测定样品中的葡萄糖含量(葡萄糖氧化酶法)。

1.2.5 杂环胺的测定 杂环胺的测定参考Yao等[15]的方法。2.0 g(或2.0 mL)样品经乙酸乙酯与NaOH混合液重复萃取3次后,将乙酸乙酯层合并,用氮吹仪吹干。以6.0 mL二氯甲烷复溶萃取物,然后经PRS柱和C18固相萃取柱富集净化后收集于10 mL离心管中,过0.22 μm滤膜后移入进样小瓶。液相色谱流动相洗脱梯度、紫外及荧光检测器编程与参考文献保持一致。以0.05 mol/L的乙酸-乙酸铵缓冲液(pH=3.2)为流动相A,乙腈为流动相B,流动相洗脱梯度为:0～25 min,由95% A和5% B匀速变为55% A和45% B;25～35 min,保持55% A和45% B不变;35～40 min,匀速变为95% A和5% B。紫外检测器波长设为263 nm,荧光检测器激发/发射波长为:0～16 min,330/440 nm;16～20 min,315/410 nm;20～40 min,335/410 nm。流速为1 mL/min,进样量为20 μL,利用外标法进行定量。

1.3 数据处理

试验设置3个重复,3个平行。数据采用SAS 8.1统计软件进行统计分析,以邓肯多重比较法(Duncan’s Multiple-rang test)进行差异显著性分析,采用Graphpad prim 5.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 反复卤煮对鸭胸及卤汤中肌酸含量的影响

肌酸是肉中天然存在的氨基酸衍生物,同时也是杂环胺的重要前体物[7]。生羊肉中添加一定量的肌酸可以显著提高酱羊肉及卤汤中Norharman和Harman生成量[16]。反复卤煮对鸭胸及卤汤中肌酸含量的影响如图1所示。生鸭胸的肌酸含量为3.60 mg/g,而熟肉的肌酸含量显著低于生肉(p<0.05)。类似地,Gibis等[17]人发现,烤制后的鸡肉肌酸含量显著低于生鸡肉。熟肉肌酸含量的降低可能是肌酸在加热过程中发生化学反应所致。卤煮1次后,鸭肉和卤汤中的肌酸浓度分别为1.53 mg/g和0.25 mg/mL。随着卤煮次数的增加,鸭肉、卤汤中的肌酸含量较新卤样品均呈现上升趋势且卤汤中肌酸上升速率快于鸭肉:煮制40次的鸭肉和卤汤中的肌酸含量分别为卤煮1次样品的1.17和5.76倍。与卤煮1次的鸭肉相比,卤汤使用30次后,鸭肉中的肌酸含量显著提高(p<0.05)。卤汤在前10次卤煮中肌酸含量上升迅速,卤煮10次后,上升速率变慢。这可能是由于卤煮10次后,卤汤中较高的肌酸浓度抑制了鸭肉中肌酸的进一步溶出。

图1 卤煮次数对鸭胸及卤汤中肌酸含量的影响Fig.1 Effect of boiling cycles on creatine content in duck breast and the corresponding braised soup注:图中不同小写字母表示差异显著(p<0.05);横坐标“0”代表生鸭肉及未经煮制的卤汤。图2同。

2.2 反复卤煮对鸭胸及卤汤中氨基酸含量的影响

游离氨基酸是重要的呈味物质,其种类和含量对滋味有重要影响[18]。鸭肉、卤汤中游离氨基酸含量分别如表1、表2所示。生鸭胸肉游离氨基酸总量为254.39 mg/100 g,这与丁玉庭等[19]研究结果接近。生肉游离氨基酸中含量最高的3种依次丙氨酸、苏氨酸和谷氨酸。Liu等[20]测定生鸭肉中的游离氨基酸,结果显示含量最高的三种游离氨基酸为丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸。这可能与鸭的品种、饲养条件的差异有关。卤煮1次后,鸭肉的氨基酸总量变为生肉的49.75%。生肉卤煮后游离氨基酸含量的降低主要是因为氨基酸反应生成了挥发性物质[21]。此外,生肉卤煮过程中,游离氨基酸随汁液大量溶入卤汤,也导致了氨基酸含量的下降。继续煮制,由于卤汤中游离氨基酸的富集,导致鸭肉的氨基酸呈现上升趋势,第40次卤煮后的鸭肉和生肉的氨基酸含量相当,是第1次卤煮鸭肉的2.01倍。

表1 卤煮次数对鸭胸游离氨基酸含量的影响(mg/100 g)Table 1 Effect of boiling cycles on free amino acids content in duck breasts(mg/100 g)

表2 卤煮次数对卤汤游离氨基酸含量的影响(mg/100 g)Table 2 Effect of boiling cycles on free amino acids content in braised soup(mg/100 g)

卤煮过程中,鸭肉游离氨基酸不断溶入卤汤。因此,卤汤中的游离氨基酸含量迅速升高。卤汤重复卤煮10次后,卤汤的游离氨基酸总量已经超过对应的鸭肉;40次后,游离氨基酸总量达到453.90 mg/100 g,是卤煮1次的18.05倍。其中,天冬氨酸、谷氨酸为呈鲜味的特征氨基酸[22],其含量多少决定了卤汤滋味是否鲜美。卤煮1次的卤汤,这两种氨基酸含量为2.89 mg/100 g,卤煮40次后,含量变为65.96 mg/100 g,表明卤汤随着使用次数的增加而愈加鲜美。

色氨酸是Norharman和Harman形成的前体物[23]。Yaylayan等[24]提出色氨酸形成Norharman的具体机制:色氨酸的Amadori重排产物经一系列反应后形成Norharman。Skog等[25]在加热冷冻干燥牛肉粉末的模型体系中添加原料含量一倍的色氨酸,结果Harman和Norharman的生成量升高为原来的23倍和7倍。由表1、2可知,煮制后鸭胸及卤汤中游离色氨酸的含量随卤煮次数的增加而显著增加(p<0.05),卤煮40次后,鸭肉、卤汤中色氨酸含量分别为卤煮1次的2.32、1.93倍。色氨酸在鸭肉和卤汤中的富集为杂环胺的生成提供了丰富的前体物。

2.3 反复卤煮对鸭胸及卤汤中葡萄糖含量的影响

葡萄糖在模拟体系中被证实参与多种杂环胺的生成[26]。鸭胸葡萄糖含量随卤煮次数的变化如图2所示。生鸭肉中葡萄糖含量为26.24 mg/100 g,卤煮1次后的鸭肉葡萄糖含量与生肉无显著差异(p>0.05)。随着卤汤使用次数的增加,鸭肉葡萄糖缓慢上升,第40次鸭肉的葡萄糖含量显著高于第1次葡萄糖含量(p<0.05)。卤汤使用1次后,葡萄糖含量为6.72 mg/100 g,随着卤汤使用次数的增多,卤汤中葡萄糖含量显著增加(p<0.05),卤煮40次后,葡萄糖含量为109.14 mg/100 g。葡萄糖具有良好的水溶性,鸭肉在反复卤煮过程中,葡萄糖不断溶解于卤汤,导致卤汤中的葡萄糖不断富集。

图2 卤煮次数对鸭胸及卤汤中葡萄糖含量的影响Fig.2 Effect of boiling cycles on glucose content in duck breast and the corresponding braised soup

表3 卤煮次数对鸭胸杂环胺含量的影响(ng/g)Table 3 Effect of boiling cycles on the content of heterocyclic amines in duck breast(ng/g)

表4 卤煮次数对卤汤杂环胺含量的影响(ng/g)Table 4 Effect of boiling cycles on the content of heterocyclic amines in braised soup(ng/g)

2.4 反复卤煮对鸭胸及卤汤中杂环胺的影响

生鸭肉和未经卤煮的卤汤未检出杂环胺。第1次煮制的鸭胸和卤汤中均检出3种杂环胺:Norharman、Harman和AαC。Liao等[27]检测水煮鸭胸的杂环胺,只检出Norharman、Harman,且杂环胺的总量低于本试验结果。Liao等[27]并未添加香辛料、食盐等辅料,而本研究中添加了八角、姜粉、食盐等辅料,这些辅料可能对杂环胺的生成有促进作用。随着卤汤重复使用次数的增加,检出的杂环胺种类不变,但各种杂环胺含量均显著增加(p<0.05)。卤汤使用40次后,鸭胸和卤汤杂环胺总量分别为2.74、1.08 ng/g,分别为卤制1次时对应浓度的1.55、2.57倍。同一煮制次数下的鸭胸杂环胺含量高于卤汤,第1、10、20、30、40次精肉和卤汤杂环胺总量之比分别为4.21、3.59、3.18、3.14、2.54,即随着卤汤使用次数的增多,鸭肉和卤汤之间杂环胺总量之比不断变小,与姚瑶[28]关于酱牛肉及卤汤中杂环胺含量之比先增大再减小的趋势不一致,这可能与酱牛肉卤煮过程中加入酱油而本试验未添加酱油有关。研究表明,卤煮过程中添加酱油可以显著增加肉制品的杂环胺含量[29]。

图3、图4分别为卤汤重复使用20次时，鸭肉样品与杂环胺标准品的紫外和荧光对比图。通过与标准品的比对，可以发现鸭肉检出3种杂环胺：Norharman、Harman和AαC。不同卤煮次数下的鸭肉、卤汤色谱图均与之类似，即在本试验设定的卤煮次数下，鸭肉和卤汤均只检出Norharman、Harman和AαC这3种杂环胺。本试验杂环胺检出种类较煎炸、炭烤等方式处理的鸭胸少[30],这可能是由于卤煮过程的温度较低所致。Norharman和Harman在Ames试验中不表现致突变性,但是它们可以提高3,4-苯并芘等化合物的致突变性[31],当其与苯胺、甲苯胺等化合物一起时,可以产生致突变性并生成DNA加合物[32]。小鼠体内实验已经证实AαC能够在肝脏中形成DNA加合物并具有一定的致突变能力[33]。国际癌症研究中心已将AαC列为2B级致癌物。因此,鸭胸及卤汤中的杂环胺残留应当引起足够重视。

图3 杂环胺标准品与鸭肉样品的紫外色谱对比图Fig.3 Comparison of the ultraviolet chromatogram of HCAs standards and meat samples注:图中1、2分别为杂环胺标准品和鸭肉样品色谱图。

图4 杂环胺标准品与鸭肉样品的荧光色谱对比图Fig.4 Comparison of the fluorescence chromatogram of HCAs standards and meat samples注:峰1、2、3分别为Norharman、Harman、AαC。

Norharman和Harman由色氨酸降解生成,而肉的成份复杂,葡萄糖、氨基酸、肌酸等物质可能对Norharman和Harman的形成产生影响。Gibis等[10]研究多种肉类烤制后的杂环胺含量与前体物的关系,发现烤肉中Norharman含量与原料肉中的葡萄糖含量呈正相关。潘晗等[16]向鲜羊肉中添加不同浓度的前体物,发现色氨酸和肌酸均能促进酱肉和卤汤中Norharman和Harman的生成;葡萄糖在低浓度范围对Norharman和Harman起促进作用,而高浓度葡萄糖可以抑制卤汤中的Norharman和Harman。AαC最早发现于大豆球蛋白的热解产物中[34],并可以在模型体系中由色氨酸或动物植物来源的蛋白质热解生成[35],关于前体物对AαC的影响未见报道。

卤煮时间对杂环胺的生成同样具有显著影响。杨潇等[36]检测卤煮1、2、3、4 h牛肉中的杂环胺,发现随着卤煮时间的延长,牛肉中检出的杂环胺种类和总量均显著升高。Liao等[27]将水煮鸭胸的时间设定为1、2、3 h,杂环胺生成量分别为0.42、0.67、0.98 ng/g。

鸭肉和卤汤杂环胺总量随卤煮次数的变化如图5所示。随着卤煮次数的增加,鸭肉和卤汤杂环胺总量线性增加,分别符合方程y=0.0224x+1.7209(R2=0.9871)和y=0.0157x+0.3821(R2=0.9442)。随卤汤使用次数的增多,鸭肉可溶性物质不断溶出,卤汤中的肌酸、氨基酸、葡萄糖含量显著升高。反复卤煮延长了卤汤中杂环胺前体物的受热时间,导致了杂环胺的进一步富集。因此,卤汤中的杂环胺含量迅速升高。试验所用鸭肉购自同一批次,其前体物的含量相对稳定,但是在卤煮过程中,卤汤与鸭肉发生强烈的物质交换,导致鸭肉中杂环胺及前体物的变化规律与卤汤一致,即随卤煮次数增多显著升高。

图5 鸭肉和卤汤中杂环胺总量随卤煮次数的变化Fig.5 Amount of heterocyclic amines in duck breast and braised soup versus boiling cycles

目前各国并没有规定肉制品中杂环胺的残留限量。Rohrmann等[2]发现杂环胺的摄入量超过41.4 ng/天会增加结肠癌的风险。若以每天摄入老汤盐水鸭100 g计,食用本试验条件下卤汤煮制108次以上的鸭肉将超过41.4 ng的标准,从而影响健康。

3 结论

本研究表明,在鸭胸肉卤煮过程中,随着卤汤使用次数的增多,卤汤和鸭肉的肌酸、游离氨基酸、葡萄糖等杂环胺前体物含量显著升高,并且杂环胺生成总量随卤煮次数直线上升。因此,在酱卤肉制品生产中,应尽量避免卤汤的反复使用。本文为进一步抑制反复卤煮过程中杂环胺的生成以及老汤的科学使用提供理论依据。